ICS 67.080 CCS B 31 湖 43 南 省 地 方 标 准 DB43/T 2324—2022 桑黄多糖液体发酵生产技术规程 Technical regulations for polysaccharide of Sanghuangporus produced in liquid fermentation 2022 - 05 - 06 发布 2022 - 08 - 06 实施 湖南省市场监督管理局 发 布 DB43/T 2324—2022 目 次 前言························································································································ Ⅲ 1 范围 ····················································································································· 1 2 规范性引用文件 ······································································································ 1 3 术语和定义 ············································································································ 1 4 发酵工艺 ··············································································································· 1 5 粗多糖的提取 ········································································································· 3 6 多糖的纯化 ············································································································ 3 7 多糖含量的测定 ······································································································ 4 8 档案管理 ··············································································································· 4 附录 A（资料性） 常用摇瓶种培养基配方 ······································································· 5 附录 B（资料性） 桑黄液体发酵培养基配方 ···································································· 6 附录 C（资料性） 桑黄多糖液体发酵生产档案 ································································· 7 I DB43/T 2324—2022 II DB43/T 2324—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省微生物研究院、湖南湘蕈生物科技有限公司。 本文件主要起草人：唐少军、喻桃生、许隽、雷平、邵晨霞、胡浩、贺月林、吴胜莲、靳磊、杨祎。 III DB43/T 2324—2022 IV DB43/T 2324—2022 桑黄多糖液体发酵生产技术规程 1 范围 本文件规定桑黄多糖液体发酵生产的发酵工艺、粗多糖的提取、多糖的纯化、含量测定和档案管理 等规范。 本文件适用于桑黄多糖的液体发酵生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1676 食用菌中粗多糖含量的测定 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 DB37/T 3995 松花粉多糖实验室提取技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 桑黄多糖 sanghuangporus polysaccharide 桑黄多糖是从桑黄中提取的一类真菌多糖，是桑黄的主要活性成分，能够提高人体的免疫力、抗肿 瘤等多种生物活性。 4 发酵工艺 4.1 工艺流程 母种→摇瓶种→发酵罐检查→清洗与空灭→投料与定容→灭菌→冷却→接种→发酵培养→粗多糖 的提取→多糖的纯化→多糖含量的测定 4.2 母种制备 母种制备应符合 NY/T 528 的要求。 4.3 摇瓶种制备 4.3.1 培养基 1 DB43/T 2324—2022 原料应符合 NY/T 1935 的规定，参照附录 A 配制。 4.3.2 装液量 采用 1000 mL 的常规三角瓶，每瓶装液量为 200 mL～300 mL，用八层纱布和牛皮纸封口。 4.3.3 灭菌 在 121 ℃～126 ℃，0.14 MPa～0.16 MPa 的压力下，保持 25 min。 4.3.4 接种 将灭菌后的培养基冷却至 30 ℃以下，无菌条件下用打孔法（10 mm 孔径）将菌丝块接种到液体摇 瓶培养基上，按每 100 mL 液体培养基接种 3 个菌丝块。 4.3.5 培养 接种后移至摇床，于 26 ℃，130 r/min 条件下培养 10 天 4.4 发酵罐清洗 4.4.1 检查 罐上全部阀门、安全阀、压力表等要求完好，工作正常。 4.4.2 清洗 流水清洗罐体内外，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。 4.5 发酵罐空灭 空罐灭菌，应在压力 0.14 Mpa～0.16 Mpa、温度 121 ℃～126 ℃下持续灭菌 40 min。 4.6 培养基配制 材料应符合 NY/T 1935 的规定，参照附录 A 规定配制。 4.7 装液量 发酵罐总体积的 60％～70％。 4.8 灭菌 用夹层预热培养基至 80 ℃后，蒸汽进罐升温至 121 ℃～126 ℃，0.14 MPa～0.16 MPa 保压恒温 40 min。 4.9 冷却 培养基冷却至 26 ℃～28 ℃。 4.10 接种 按常规接种方式接种，接种量为 10％（V/V） 。 4.11 发酵培养 2 DB43/T 2324—2022 罐温为 26 ℃～28 ℃， 罐压为 0.02～0.04 MPa， 通气量为 1︰0.5 V/V•min，搅拌速度为 130 r/min～ 160 r/min，培养时间为 8～10 d。 5 粗多糖的提取 5.1 发酵上清液收集 发酵后的菌液在 5000 rpm、4 ℃条件下离心 15 min，弃去沉淀，收集上清。 5.2 除蛋白 上清液经旋转蒸发浓缩 10 倍，用 Sevag 法除蛋白，操作过程应符合 DB37/T 3995 的规定。 5.3 沉淀多糖 将除去蛋白后的多糖溶液缓慢加入到 4 倍量无水乙醇中，4 ℃条件下静置 8 h～10 h，然后在 10000 rpm、4 ℃条件下离心 10 min 后收集底部沉淀。 5.4 干燥 收集到的沉淀经过冷冻干燥后得到桑黄粗多糖。 6 多糖的纯化 6.1 离子交换纯化 6.1.1 层析柱填装 将 DEAE-Sepharose Fast Flow 填料装填于 Column XK 26/40（内径：26 mm，高度 400 mm）层析柱 中，体积为 150 mL，用 Tris-HCl 溶液（55 mM，pH 7.8～8.0）以 1.5 mL/min 流速过夜平衡层析柱。 6.1.2 过柱分离 将粗多糖溶于 Tris-HCl 中，配成浓度为 10 mg/mL 溶液，用 0.22 μm 滤膜过滤后上样。流动相使 用 Tris-HCl(A)和含 1 M NaCl 的 Tris-HCl(B)进行梯度洗脱，流速设置为 2.0 mL/min，每 3 min 收集 一次洗脱液。 6.2 分子筛纯化 6.2.1 层析柱填装 将 Sephadex LH-20 装填于 Column XK 16/100（内径：16 mm，高度 1000 mm）层析柱中，体积为 150 mL，用 Tris-HCl 溶液（55 mM，pH 7.8～8.0）以 0.5 mL/min 流速过夜平衡层析柱。 6.2.2 过柱分离 将上一步纯化收集得到的多糖组分溶于 Tris-HCl 中，配成浓度为 5 mg/mL 溶液，用 0.22 μm 滤膜 过滤后上样。流动相使用 Tris-HCl 洗脱液，流速为 0.5 mL/min，每 10 min 收集一次洗脱液。将得到 的多糖进行冷冻干燥。 3 DB43/T 2324—2022 7 多糖含量的测定 多糖含量的测定应符合标准 NY/T 1676 的规定。 8 档案管理 生产档案应有电子档案和纸质档案保存，资料记录完整准确，档案内容见附录 C。档案记录一式 2 份保存于生产基地和技术指导单位，档案保存 3 年以上。 4 DB43/T 2324—2022 附 录 A （资料性） 常用摇瓶种培养基配方 A.1 玉米粉（或玉米淀粉）1％，蔗糖 2％，蛋白胨 0.2％，酵母粉 0.3％～0.5％，磷酸二氢钾 0.1％， 硫酸镁 0.06％，pH 值 6.0。 A.2 葡萄糖 3％，豆饼粉 2％，玉米粉 1％，酵母粉 0.5％，磷酸二氢钾 0.1％，碳酸钙 0.2％，