ICS 67.080 CCS B 31 湖 43 南 省 地 方 标 准 DB43/T 2339—2022 辣椒花药开放式培养技术规程 Technical regulation for anther of pepper in open culture 2022 - 05 - 06 发布 2022 - 08 - 06 实施 湖南省市场监督管理局 发 布 DB43/T 2339—2022 目 次 前言························································································································ Ⅲ 1 范围 ····················································································································· 1 2 术语和定义 ············································································································ 1 3 试剂和设备 ············································································································ 1 4 培养基配制 ············································································································ 1 5 花蕾处理 ··············································································································· 2 6 花药接种 ··············································································································· 2 7 胚状体诱导 ············································································································ 2 8 胚状体分化成苗 ······································································································ 2 9 单倍体植株炼苗与移栽 ····························································································· 2 10 单倍体植株加倍 ···································································································· 3 附录 A（资料性） 辣椒花药开放式培养所需试剂 ······························································ 4 附录 B（资料性） 辣椒花药开放式培养所需仪器 ······························································ 5 附录 C（资料性） 辣椒花药开放式培养培养基配方 ··························································· 6 I DB43/T 2339—2022 II DB43/T 2339—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件主要起草单位：湖南农业大学、湖南省蔬菜研究所。 本文件主要起草人：杨博智、周书栋、肖佳林、郑井元、刘周斌、欧立军、戴雄泽、邹学校。 III DB43/T 2339—2022 IV DB43/T 2339—2022 辣椒花药开放式培养技术规程 1 范围 本文件规定了辣椒花药开放式培养的术语和定义、试剂和设备、培养基配制、花蕾处理、花药接种、 胚状体诱导、胚状体分化成苗、单倍体植株炼苗与移栽、单倍体植株加倍等内容。 本文件适用于辣椒花药开放式培养。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 花药开放式培养 Anther open cultivation 指通过往培养基中添加杀菌剂，在脱离无菌环境条件下，剥取辣椒离体花蕾中花药，并将花药接种 至培养基中进行培养的一种组织培养方式。 2.2 胚状体 Embryoid 指辣椒花药离体培养过程中，花药中小孢子经过胚胎发生和发育过程，形成与合子胚相似的结构。 胚状体进一步培养可形成单倍体植株。 2.3 单倍体植株 Haploid plant 由辣椒花药小孢子发育获得，具有配子染色体的再生植株。 2.4 双单倍体植株 Double haploid plant 对辣椒单倍体植株生长点进行秋水仙素加倍处理后获得的二倍体植株。 3 试剂和设备 3.1 试剂 所有试剂等级均为分析纯，见附录 A。 3.2 仪器设备 所需仪器设备见附录 B。 4 培养基配制 4.1 培养基类型 培养基包括胚状体诱导培养基、胚状体分化成苗培养基两种，其配方见附录 C。 1 DB43/T 2339—2022 4.2 消毒 2 培养基配制后调 pH 值为 5.8～6.0， 然后置于高压灭菌锅中 121 ℃， 1.05 kg/cm 条件下灭菌 15 min。 植物生长调节剂及杀菌剂在培养基经高温灭菌，冷却至 60 ℃左右再加入。 5 花蕾处理 5.1 花蕾采集和低温预处理 现蕾期选择生长势好、无病虫害的辣椒植株，采集花萼与花瓣齐平或花瓣微露出花萼的花蕾，放入 自封口袋或离心管中，置于冰箱中 4 ℃低温预处理 48 h。 5.2 花蕾消毒 取花蕾，左手捏住花蕾底部花柄，右手用尖头镊子绕离花蕾顶端约 3/4 处轻轻划圈，剥去花蕾顶部 的花萼，露出青绿色花瓣。将花蕾置于 5％的次氯酸钠溶液中消毒 10 min 后，无菌水冲洗 2～3 遍，用 镊子将花蕾夹入垫有双层无菌滤纸的培养皿中，吸干花蕾表面水分，用于花药接种。 6 花药接种 选择普通实验室作为接种室，接种前先用紫外线灯照射房间 30 min，75％酒精擦拭试验台面。取 镊子，置于酒精灯火焰外焰上来回移动，灼烧镊子 30 s 左右。待镊子冷却后，左手捏住花蕾底部花柄， 右手用镊子尖端微微挑开花瓣，再徒手轻轻挤压花瓣，使花药自然脱落于胚状体诱导培养基表面。接种 后盖好培养皿盖子，用封口膜将培养皿封口，记号笔注明接种花药的辣椒品种名称和接种日期。花药接 种后每隔 15 d 时须转接至新配制的同成分培养基上培养。 7 胚状体诱导 将接种后的培养皿置于恒温培养箱中，35 ℃黑暗条件下培养 8 d，之后再将温度调至 25 ℃继续黑 暗培养，直至有白色胚状体产生。 8 胚状体分化成苗 取出花药，用无菌镊子轻轻剥离白色胚状体，转接至胚状体分化成苗培养基中培养至其分化成苗。 分化的组培苗为单倍体幼苗。此阶段培养条件为：有光照时温度为 25±0.5 ℃，无光照时温度为 20± 0.5 ℃，光照强度为 3 000 lx，光照时间为 16 h/d。 9 单倍体植株炼苗与移栽 将生长至 6 叶期的单倍体幼苗从培养基中取出，用约 20 ℃的清水轻轻清洗幼苗根部，去除根部培 养基。将幼苗移入基质（蛭石、珍珠岩和草炭体积比为 6 : 3 : 2）中，遮阴、保湿，促进缓苗。 植株度过缓苗期后，将苗室的环境条件逐步调整到室外条件进行炼苗，15 d 后将单倍体幼苗移栽至 大棚中。 2 DB43/T 2339—2022 10 单倍体植株加倍 配制 0.25％的秋水仙碱溶液，避光保存。用脱脂棉包裹单倍体植株侧枝生长点，往脱脂棉上滴加 秋水仙素溶液，黑暗处理 8 h，连续加倍处理 7 d，将脱脂棉取下，用蒸馏水冲洗生长点，收获带种子 的果实，收集种子，种子播种后获得的植株为双单倍体植株。 3 DB43/T 2339—2022 附 录 A (资料性) 辣椒花药开放式培养所需试剂 试剂 名称 无机试剂 次氯酸钠、氢氧化钠、盐酸、硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、 硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、氯化钴、硫酸亚铁、EDTA 二钠盐 有机试剂 酒精、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、叶酸、生物素、谷氨酰胺、丝氨酸、 脯氨酸 植物生长调节剂 抗生素 其他 4 a-萘乙酸、激动素 百菌清、链霉素 琼脂粉、蔗糖、活性炭 DB43/T 2339—2022 附 录 B (资料性) 辣椒花药开放式培养所需仪器 设备名称 量程或精确度 超纯水仪 / 电子分析天平 精确度：0.0001 g pH 计（或 pH 试纸） 3.0～7.0 刻度容量瓶 量程 100 mL、500 mL 移液枪 量程分别为 100 µL、1 mL、10 mL 低温冷藏冰箱 温度范围：0～10 ℃ 高压蒸汽灭菌锅 / 5 DB43/T 2339—2022 附 录 C (资料性) 辣椒花药开放式培养培养基配方 6 培养基名称 培养基配方成分 胚状体诱导培养基 720 mg/L 硝酸铵、950 mg/L 硝酸钾、166 mg/L 氯化钙、185/L mg 七水硫酸镁、68 mg/L 磷酸二氢钾、10 mg/L 硼酸、25 mg/L 四水硫酸锰、10 mg/L 七水硫酸锌、0.25 mg/L 三氧化钼、0.025 mg/L 硫酸铜、0.025/L mg 氯化钴、27.8