ICS 65.020.30 B23 张 家 DB1307 口 市 地 方 标 准 DB 1307/T 341—2020 马铃薯脱毒试管（瓶）苗扩繁技术规程 2020-07-29 发布 2020-08-13 实施 张家口市市场监督管理局 发布 DB1307/T 341—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 规则起草。 本标准由张家口市农业农村局提出并归口。 本标准起草单位：张家口市种子管理站。 本标准主要起草人：刘齐光、李金荣、杨博文、郑云、王曼、张永清、郭丽莎、吴印宗、杨晓红、 赵祥、李艳清、马向辉、李中华、薛木易。 2 DB1307/T 341—2020 马铃薯脱毒试管（瓶）苗扩繁技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯脱毒试管（瓶）苗扩繁的术语和定义、扩繁工作室与扩繁操作技术规范。 本标准适用于张家口地区马铃薯脱毒试管（瓶）苗的扩繁生产。 2 术语和定义 2.1 脱毒苗 经检测确认不带马铃薯 X 病毒（PVX）、马铃薯 Y 病毒（PVY）、马铃薯 S 病毒（PVS）、马铃薯 卷叶病毒（PLRV）、马铃薯 M 病毒（PVM）、马铃薯 A 病毒（PVA）、马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd） 的试管苗和马铃薯帚顶病毒（PMTV）的试管（瓶）苗。 2.2 核心苗 经过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状的脱毒苗。 2.3 基础苗 由核心苗繁殖的经检测无病毒的脱毒苗。 3 扩繁工作室 3.1 布局原则 脱毒苗生产工作室布局应遵循方便消毒，减少污染的原则，遵守操作流程。应具备更衣室、缓冲 室、灭菌室、配制室、观察室、扩繁室、培养室等，各房间应隔离。周边环境应无污染，并与马铃薯 生产田隔离。 3.2 工作室平面示意图 图 1 工作室平面示意图 3 DB1307/T 341—2020 3.3 设备、试剂 脱毒试管（瓶）苗生产的设备、试剂参见附录 A。 3.4 卫生要求 3.4.1 扩繁室、培养室应保持卫生，定期消毒，每周至少消毒一次。 3.4.2 切繁前扩繁室应强制过滤通风，并提前 2 h 开启紫外线灯，工作人员进入前关闭紫外线灯。切 繁时扩繁室门窗应时刻紧闭，并保持干燥。 3.4.3 工作人员进入更衣室 1，脱下外衣，换上拖鞋，签到处登记，然后进入更衣室 2，换上新的拖 鞋，穿好白大褂，戴上帽子到洗手池处用肥皂洗净双手，而后慢慢通过风淋室（风淋室内侧身两次）， 进入更衣室 3，换上软底鞋经过缓冲室（缓冲室应有消毒装置，可放置消毒剂，进入时鞋底消毒）并 穿上无菌衣和无菌鞋，进入扩繁工作区。操作过程工作人员双手和工作台面要经常用 75%的酒精擦拭。 3.4.4 每次使用超净工作台前，应提前 20 min 打开紫外灯及风机。切繁时关闭紫外灯并打开照明灯 保持风机开启状态，超净工作台面及内壁用 75%酒精擦拭消毒，超净工作台换气滤网需每月更换一次。 3.4.5 操作使用的所有工具，使用前应高温灭菌。操作过程中镊子、剪刀、解剖刀等工具每次使用前 接触植物材料的部分应灼烧或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用，避免交叉污染。经灭菌的器械摆 放在器械支架上。 3.4.6 发现污染材料及时清除出扩繁室，并做无害化处理。 4 扩繁操作 4.1 培养基 使用 MS 培养基（配方参见附录 B）或其他培养基。 4.2 试管（瓶）制作 将配制好的培养基装入容器中，每瓶培养基厚度 15 mm 左右，用封口膜（盖）封口；在 121 ℃～ 122 ℃灭菌锅中灭菌 21 min～22 min，取出后放置 3 d～7 d 待用。如发现被污染的培养基，及时清除。 4.3 扩繁材料选取 选取经检测合格的基础苗。 4.4 扩繁操作 4.4.1 试管（瓶）口灭菌 试管（瓶）口火焰灭菌，在拔封口膜（盖）前用火焰快速灼烧试管（瓶）口外侧，打开试管（瓶） 后再瞬时灼烧试管（瓶）口及封口膜（盖）内侧。 4.4.2 切繁 在酒精灯火焰附近，一只手斜握培养瓶，另一只手拿剪刀剪取脱毒苗茎段放入试管（瓶）。根据基 础苗长势，确定切断长度，确保每个茎段至少有一个腋芽和一片叶片。用定植针将茎段均匀的向上插 入或平铺在培养基上，使腋芽与培养基充分接触。 4.4.3 封口 切繁后旋转试管（瓶）口，火焰灭菌数秒后迅速封口。 4 DB1307/T 341—2020 4.5 标识 在瓶壁上注明材料名称缩写、编号、接种人员代号和接种日期。 4.6 培养条件 将切繁后的试管（瓶）放在培养架上。培养室白天培养温度 18 ℃～22 ℃，光照 17 h，光照强度 2000 Lx～3000 Lx，夜间温度 15 ℃～18 ℃。培养 15 d～20 d，待茎段长出 7～8 个叶片可再次切段扩 繁。 5 DB1307/T 341—2020 附 录 A （资料性附录） 脱毒试管（瓶）苗生产的设备、试剂 A.1 生产设备 A.1.1 A.1.2 A.1.3 A.1.4 A.1.5 A.1.6 A.1.7 A.1.8 A.1.9 A.1.10 A.1.11 A.1.12 A.1.13 风淋系统 超净工作台 空调、冰箱 紫外灯 高压灭菌锅 培养架 器械灭菌器 器械柜 器械支架 酒精灯 镊子、剪刀、定植针、解剖刀 试管（瓶） 封口膜、橡皮筋、封口盖 A.2 试剂 A. A. A. A. 2.1 2.2 2.3 2.4 消毒剂 95%酒精、75%酒精 pH 试纸 附录 B 所用试剂 6 DB1307/T 341—2020 附录 B （资料性附录） 表 B.1 MS 培养基储备液配制 母液 A B C D 成分 浓度（mg/L） 硝酸铵（NH4NO3） 33000 硝酸钾（KNO3） 38000 磷酸二氢钾（KH2PO4） 3400 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 7400 氯化钙（CaCl2·2H2O） 8800 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 5570 乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA·2H2O） 7450 碘化钾（KI） 166 钼酸钠（Na2MoO4·2H2O） 50 硫酸铜（CuSO4·5H2O） 5 氯化钴（CoCl2·6H2O） 5 硫酸锰（MnSO4·4H2O） 4460 硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 1720 硼酸（H3BO3） 1240 盐酸硫胺素（维生素 B1） 20 盐酸吡哆素（维生素 B6） 100 甘氨酸 400 烟酸 100 肌醇 20000 每升培养基用量（mL） 50 5 5 5 注：配置母液 A 时，最后加氯化钙； 配置母液 B 时，分别溶解硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，溶解时要一边加热一边搅拌，待两种溶 液都溶解后在混合在一起，继续加热使其充分螯合，冷却后用蒸馏水定容到 1000mL； 固体培养基配置：MS 培养基储备液+30g/L 蔗糖+7g/L 琼脂，pH 为 5.6～5.8。 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 7