ICS 65.020.30 B 43 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2247—2020 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR 检测方法 Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 - 03 - 03 发布 浙江省市场监督管理局 2020 - 04 - 03 实施 发 布 DB33/T 2247—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓 兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。 I DB33/T 2247—2020 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条 件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。 2 术语和定义 2.1 鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV） 属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病 死亡。 3 实验条件 3.1 主要仪器设备 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 3.1.10 PCR 仪。 荧光定量 PCR 仪。 微量移液器。 组织匀浆器。 电泳仪。 电泳槽。 水浴锅。 紫外凝胶成像系统。 高速台式低温离心机。 生物安全柜。 3.2 试剂 3.2.1 0.01M 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4 PBS）：称取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO4•12H2O、 0.2 g KH2PO4，将上述试剂溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然 后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。 3.2.2 氯仿。 3.2.3 异丙醇。 3.2.4 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌去离子水：用 DEPC 50 μL，加超纯水至 100 mL，室温过夜， 121℃高压灭菌 15 min，分装到 1.5 mL DEPC 处理过的离心管，冻存备用。 3.2.5 75%乙醇：取新开启的无水乙醇 75 mL，加 DEPC 水至 100 mL，混匀，-20℃预冷。 1 DB33/T 2247—2020 3.2.6 溴化乙锭 （EB）：取 1.0 g 溴化乙锭，加去离子水，定容至 100 mL。充分溶解后的溴乙锭溶 液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为 0.5 μg /mL。 3.2.7 1×TAE 缓冲液：取 242 g 羟基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2 g 二水乙二铵四乙酸二钠、57.1 mL 冰乙酸，加去离子水定容至 1 L，配置成 50×TAE 电泳缓冲液；量取 20 mL 的 50×TAE 电泳缓冲液，加 入去离子水定容至 1 L，室温保存。 3.2.8 1%琼脂糖凝胶：称取 1.0 g 琼脂糖，加入 1×TAE 电泳缓冲液 100 mL，轻轻混匀后加热，使琼脂 糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至 50℃～60℃时，加 EB 溶液（终浓度 0.5 μg/mL）或 5 μL 核酸染料，摇 匀后倒入制胶板中，厚度为 3 mm～5 mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。 3.2.9 DNA 相对分子质量标准物 Marker：DL 2000。 3.2.10 10×加样缓冲液：称取 25 g 聚蔗糖、0.1 g 溴酚蓝、0.1 g 二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至 100 mL。 3.2.11 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂盒。One Step Prime Script™ RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 RT-PCR 缓冲液，酶混合物，dNTP 混合物，无 RNA 酶的水等。 3.2.12 M-MLV 反转录酶。 3.2.13 RNA 酶抑制剂。 3.2.14 TaqDNA 聚合酶。 3.2.15 dNTPs。 3.2.16 引物：RT-PCR 扩增引物,见表 1；实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针，见表 2。 表1 RT-PCR 扩增引物 引物名称 引物序列 DTMUV引物P1 5'- GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3' DTMUV引物P2 5'- AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3' 表2 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针 引物名称 引物序列(5'-3') DTMUV 引物 P3 AAGTCAGGCCAGGGAATCC DTMUV 引物 P4 CATGCACCCAGATTTGTTAACC DTMUV探针 FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB 4 操作步骤与结果判定 4.1 样品采集与处理 4.1.1 组织器官 5.1.1.1 用无菌镊子和剪刀采集患病或病死禽类各种组织与器官（肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等）， 装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号。 5.1.1.2 取待检组织样品适量（0.1g），按1:5 倍（W/W）加入无菌 0.1M PH 7.4 PBS，于灭菌并烘干 的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融2次后，4 ℃，3000 r/min 离心5 min，取上清1 mL转至无 菌的 1.5 mL离心管中液，编号备用。 2 DB33/T 2247—2020 4.1.2 抗凝血、血清 4.1.2.1 抗凝血 用无菌注射器直接吸取全血，加入含抗凝剂（除肝素外）的抗凝管中，充分混匀，编号备用。 4.1.2.2 血清 用无菌注射器直接吸取全血，自然凝固，3000 r/min 离心5 min，取上清液。 4.1.3 咽拭子、肛拭子 用无菌棉签刮取家禽的咽部或泄殖腔粘膜，放入含0.1 M PH 7.4 PBS的离心管内。3000 r/min 离 心5 min，取上清液，编号备用。 4.1.4 样品保存 制备样品在冷藏条件不宜超过4 h，长期保存应放入-70℃保存。 4.2 RNA 提取 4.2.1 设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为灭活的鸭坦布苏病毒感染 SPF 鸡胚尿囊液或者感染禽的 组织，阴性对照为正常 SPF 鸡胚尿囊液或者正常禽组织。 4.2.2 按下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化 RNA 试剂盒提取： a) 样品处理好后，在样品处理区，取 n+2 个 1.5 mL DEPC 处理过的灭菌离心管，其中 n 为待检样 品数、1 个阳性对照管和 1 个阴性对照管，对每个管进行编号标记； b) 取 250 μL 匀浆液，加入 750 μL RNA 提取试剂 Trizol 置入一个 1.5 mL 离心管，震荡数次， 静置 5 min； c) 加入 200 μL 预冷的氯仿，震荡混匀，室温静置 5 min，4℃12 000 r/min 离心 15 min； d) 吸取上层水相至一新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置 15 min，4℃ 12 000 r/min 离心 15 min，离心后在离心管边和底部可见有胶样 RNA 沉淀，弃上清； e) 吸弃上清，加入 500 μL 75%乙醇，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，清洗 2 次，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min； f) 吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加入 20 μL DEPC 处理水溶解； g) 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增；若需长期保存，需置于-70℃冰箱保存。 4.3 RT-PCR 反应 4.3.1 一步法 RT-PCR 4.3.1.1 RT-PCR 反应体系 设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表3中的成分。 表3 一步法 RT-PCR 反应体系 试剂 体积 2×一步法RT-PCR缓冲液 12.5 μ L DTMUV引物P1（20μ mol/L） 0.5 μ L DTMUV引物P2（20μ mol/L） 0.5 μ L 3 DB33/T 2247—2020 表3（续） 试剂 体积 RNA提取液 2.0 μ L 酶混合液 1.0 μ L DEPC水 8.5 μ L 4.3.1.2 反应条件 反转录：50 ℃ 30 min；预变性：94 ℃ 2 min；扩增：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共30个循环。72 ℃延伸10 min。 4.3.2 两步法 RT-PCR 4.3.2.1 反转录 取5 μL RNA提取液, 加1 μL DTMUV引物P2，70℃水浴5 min；冰浴2 min，继续加入表4中的成分， 37℃ 水浴1 h，合成cDNA，取出直接进行PCR或置-20℃保存。 表4 反转录反应体系 试剂 体积 5×反转录反应缓冲液 4 μ L 0.1 mol/L DTT 2 μ L 2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L M-MLV反转录酶 0.5 μ L RNA酶抑制剂 0.5 μ L DEPC水 5 μ L 4.3.2.2 PCR 反应体系 先加入去离子灭菌水，然后再按照顺序逐一加入表5中成分，每一次都应加入到液面以下。全部加 完后，混匀，瞬时离心，使液体沉降到PCR管底。 表5 PCR 反应体系 试 剂 体 积 反转录产物 1.25 μ L DTMUV引物P1（20 μ mol/L） 0.5 μ L DTMUV引物P2（20 μ mol/L） 0.5 μ L 10×PCR Buffer 2.5 μ L 2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L TaqDNA聚合酶 0.25 μ L 灭菌去离子水 18 μ L 4.3.2.3 反应条件 4 DB33/T 2247—2020 预变性：94℃ 3 min；扩增：94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；72℃延伸10 min。 4.3.3 电泳 反应结束后，分别取5 μL各检测样品及阳性和阴性对照样品RT-PCR产物并与0.5 μL加样缓冲液（10 × Loading buffer）混合，然后加入到1.0 %琼脂糖凝胶板的加样孔中，随后