ICS 65.020 B 30 铜 DB5206 仁 市 地 方 标 准 DB 5206/T 81—2018 代替 DB 522200/T 62-2009 红薯脱毒种薯检验规程 2018-12-06 发布 2018-12-06 实施 铜仁市质量技术监督局 发 布 DB 5206/T 81－2018 目 次 前言.....................................................................Ⅱ 1 适用范围................................................................1 2 规范性引用文件..........................................................1 3 术语和定义..............................................................1 4 控制和汰除的病害........................................................2 5 质量要求................................................................2 6 检验方法................................................................2 7 判定规则................................................................5 I DB 5206/T 81－2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规 则起草。 请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责 任。 本标准代替DB 522200/T 62-2009《红薯脱毒种薯检验规程》。主要变化是进行编辑性修 改。 本规程由铜仁市农业委员会提出并归口。 本规程起草单位：铜仁市种子管理站。 本规程参加单位：思南县农牧科局、松桃县种子管理站、沿河县种子管理站、石阡县种 子管理站、印江县种子管理站、万山区种子管理站、玉屏县种子管理站、德江县种子管理站 江口县种子管理站、 本规程主要起草人：李朝霞、李永凤、甘坤俊、罗会群、邓 娅、代洪江、冉小芳、安 兴智、张羽军、王显权、廖雪红、石俊、陈正福、陈忠 本标准的历次版本发布情况为： ──DB 522200/T 62-2009。 II DB 5206/T 81－2018 红薯脱毒种薯检验规程 1 适用范围 本规程规定了各级红薯脱毒种薯（苗）的质量标准、检验方法、判定规则。 本规程适用于红薯脱毒种薯（苗）繁育、生产、销售过程中的质量鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1200 甘薯脱毒种薯 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 脱毒试管苗 应用茎尖分生组织培养技术获得，经检测确认不带红薯羽毛状斑驳病毒、红薯潜隐病毒、 红薯褪绿斑病毒的试管苗。 3.2 脱毒种薯（苗） 从育种家种子繁殖试管苗开始，经逐代繁殖增加脱毒种薯（苗）数量的种薯生产体系生 产出来的种薯（苗）。分为育种家种子、原原种、原种、生产用种四个级别。 3.2.1 育种家种子 由育种家直接生产和掌握的原始种子，具有该品种的典型性和遗传稳定性，纯度 100%， 不带病毒和其它病虫害，产量及其它主要性状符合推广时的原有水平。 3.2.2 原原种：用育种家种子或典型品种的脱毒试管苗在防虫网室、温室条件下生产的符 合质量标准的种薯苗。 3.2.3 原种：用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯（苗） 。 3.2.4 生产用种：用原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯（苗）。 3.3 病虫害允许率 指脱毒种薯（苗）繁殖田中病害株比率和虫害株比率。 3.3.1 病害株：主指脱毒种薯（苗）病毒病株、真菌病株、细菌病株的比率。 1 DB 5206/T 81－2018 3.3.2 虫害株：主指脱毒种薯（苗）虫害株比率。 3.4 混杂株允许率 主指脱毒种薯（苗）繁殖田中混杂其它红薯品种植株比率。 3.5 薯块整齐度 单块质量在 100g—500g 的块根质量占块根总质量的比率。 3.6 有缺陷薯 指机械损伤、虫鼠伤、畸形块根质量占块根总质量的比率。 3.7 杂质 指浮土、块根上所沾的泥土、无种用价值的块根，以及其他有机、无机质量。 4 控制和汰除的病害 4.1 控制的病害 指通过控制病害的发生程度以达到脱毒种薯（苗）质量要求的病害。 主指红薯的病毒病（即红薯羽状斑驳病毒、红薯潜陷病毒、红薯褪绿病毒）、黑斑病、 疮痂病、蔓割病、茎线虫病。 4.2 汰除的病虫害 指不能在达到质量要求的脱毒种薯（苗）上发生的病虫害。包括：根结线虫病、细菌性 萎蔫病（红薯瘟）、根腐病、红薯蚁象。 5 质量要求 5.1 各级别脱毒种薯（苗）繁殖田中带病植株允许率应符合附录 A 表 A.1 要求。 5.2 各级别脱毒种薯块根质量指标应符合附录 A 表 A.2 要求。 6 检验方法 6.1 脱毒苗的检验 某一品种经茎尖分生组织获得一批组培再生苗后，要逐株鉴定带病毒状况，经检测确 认不带红薯羽毛状斑驳病毒、红薯潜隐病毒、红薯褪绿斑病毒的组培苗才能确认是脱毒苗。 检测方法：有目测法、指示植物确认法、血清法（酶联免疫检测）。 6.1.1 目测法 目测法是根据红薯叶片和薯块上出现的典型症状判断红薯是否感染病毒。红薯病毒病 的症状主要包括：（1）叶斑型：主要有紫色羽状斑、紫斑、紫环斑、黄色斑或者枯斑。（2） 花叶型：苗期感病后，初期叶脉呈网状透明，然后沿叶脉出现不规则黄绿相间的花叶斑纹。 2 DB 5206/T 81－2018 （3）卷叶型：叶片边缘上卷，严重者可形成杯状。（4）叶片皱缩型：病苗叶片较小，皱缩， 叶缘不整齐，甚至扭曲畸形。（5）叶片黄化型：包括叶片黄化及网状黄脉。薯块上的症状 主要是产生黑褐色或黄褐色龟裂纹。 病毒病的症状可因病毒种类、红薯品种以及环境条件等因素的影响而改变，根据症状只 能作初步判断。另外，目测法应注意区分红薯品种特性以及由于土壤水份多、营养失调等原 因造成的生理病害与病毒病症状的差异。 6.1.2 指示植物法 常用巴西牵牛(Ipomoea setosa)作指示植物，几乎所有侵染红薯的病毒都能感染巴西牵 牛，因此，将薯苗嫁接在巴西牵牛上，从巴西牵牛的显症情况可判断薯苗是否带毒。具体嫁 接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，将芽尖削成楔形，将具 3-4 片真叶的巴西牵牛作砧木，在 其茎中部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防虫网室内遮阴保湿 3-4d，然后在自 然光照下观察记载牵牛的显症情况，一般嫁接后 25～30d 左右开始出现症状,显症初期新生 叶出现系统性明脉，以后发展为花叶或皱缩等症状。 6.1.3 血清学检测 常用的血清学检测方法为酶联免疫吸附法，它具有快速和能检测大量样品的特点，在大 量检测样品时较常应用。具体检测方法如下： (1)样品处理：取直径约为 1cm 的样品叶片（约 0.1g），加入 1ml 抽提缓冲液，迅速研磨， 置于离心管中，取上清液供检测用。 (2)点样：将 NC 膜在 TBS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, )中充分湿润，然后放 在一张干燥滤纸上，让其稍事干燥，用铅笔作好记号，用微量取样器进行点样，点样后 让 NC 膜自然干燥。 (3)反应: （a）封闭: 将点样后的 NC 膜转入封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)中封闭 1 小时或 4℃封闭过 夜。 (b) 第一抗体反应: 封闭后的 NC 膜用 TBST(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)漂洗 2-3 次, 每次 5-10min, 加入用 TBST 稀释的病毒专化抗血清(1:2000) 37℃ 保温 1h, 再用 TBST 洗膜 3 次, 每次 5-10min。 (c) 第二抗体反应: 加入 TBST 稀释的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔 IgG(1:5000), 37℃保 温 1h, 再用 TBST 洗膜 3 次, 每次 5-10min。 (d) 显色: 避光条件下, 将 NC 膜置于含 330μg/ml NBT 和 165μg/ml BCIP 的碱性磷酸 酯酶缓冲液(100mM Tris-HCl, pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCL2)中显色至样点清晰, 将膜放 入蒸馏水中漂洗, 终止显色反应。取出晾干, 拍照。 6.2 脱毒试管苗种性鉴定法：将脱毒试管苗种植在防虫网室内，每株系种植 3 株，对照原 品种特征特性，剔除变异株系和混杂株系，收获时检验块根质量，与原品种一致的株系进行 扩大繁殖。 6.3 扩繁苗的检验 随机抽取 1%∽2%脱毒试管苗经目测法淘汰弱苗和显症苗后，再进行指示植物确认，经 指示植物检测为不显症或为阴性后，方可用于扩繁，若指示植物检测中有一株为阳性，都不 能进行扩繁，还要再进行血清法（酶联免疫检测）不显症后，方可用于扩繁。 3 DB 5206/T 81－2018 6.4 不同级别脱毒苗的检测方法 6.4.1 茎尖苗的检测 茎尖苗的检测：首先采取目测法淘汰弱苗和显症苗（因为脱毒茎尖苗和带毒茎尖苗在 形态、长势上有明显差异，前者生长快、叶片平展、植株较健壮；后者长势弱，叶片上常出 现花叶、明脉和褪绿斑等症状）。然后再用血清学（酶联免疫检测）方法进行筛选，呈阴性 的样品再进行嫁接。每个茎尖苗一般嫁接 3-5 株，有 1 株发病即认为该样品带病毒，待筛选 出都不发病的样品才可重复嫁接。 6.4.2 原原种田的检测 原原种田的检测：首先在防虫网室内种植原原种和若干株巴西牵牛，定期观察巴西牵牛 是否显症、以判断是否有蚜虫传毒；对原原种田还要进行定期普查，及时淘汰显症株和变异 株；另外对原原种田要定期取样，用嫁接指示植物法或酶联免疫检测法进行检测， 以判断原原种田病毒的感染情况，对于病毒感染率超标的繁种田要降级使用。 6.4.3 原种田的检测 脱毒原种的繁殖要在有一定隔离区的地方进行，即周围 500m 内不能种植非脱毒薯。原 种田的病毒检测以目测法和田间种植巴西牵牛为主，必要时田间