ICS DB63 备案号：20481-2010 青 海 省 地 方 标 准 DB63/T 862—2009 实验室冬虫夏草真菌--中国被毛孢 真菌分离技术规程 2009-12-07 发布 青海省质量技术监督局 2010-01-10 实施 发布 DB63/T 862—2009 目 次 前言...................................................................................II 1 范围..................................................................................1 2 术语..................................................................................1 3 分离用培养基的制备....................................................................1 4 冬虫夏草的采收........................................................................1 5 冬虫夏草真菌分离的环境要求............................................................2 6 冬虫夏草真菌的分离步骤................................................................2 7 分离后的培养..........................................................................2 8 菌种鉴定..............................................................................2 9 分离时的注意事项......................................................................2 I DB63/T 862—2009 前 言 本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。 本规程由青海省畜牧兽医科学院草原所负责起草。 本规程起草人: 李玉玲、刘欣、马少丽、徐海峰、张宗豪。 本规程由青海省质量技术监督局批准发布。 II DB63/T 862—2009 实验室冬虫夏草真菌--中国被毛孢 真菌分离技术规程 1 范围 本规程规定了实验室冬虫夏草（Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.）的收集、分离的环境条件、 分离的设备、分离技术等冬虫夏草真菌的分离技术措施。 本规程适用于实验室冬虫夏草真菌——中国被毛孢的分离。 2 术语 2.1 中国被毛孢（Hirsutella sinensis Liu,Guo ,Yu & Zeng） 指冬虫夏草的无性型。 2.2 分离 从冬虫夏草体内分离出中国被毛孢的过程。 2.3 消毒 是指杀死或消除物体表面所有病原微生物的措施。 2.4 灭菌 是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭的方法。 2.5 无菌操作 指采用经过一定消毒措施处理之后的环境、器具及人为操作的工作方式。 2.6 培养基 是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物 质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。 3 分离用培养基的制备 3.1 牛肉汤的制备 先将新鲜牛肉去除筋和脂肪，然后取1 kg牛肉加蒸馏水2 kg放入容器内煮沸，煮沸约40min后将肉 渣滤去，肉水经121℃、0.1MPa高压灭菌30min后备用。 注：①煮沸时应边煮边搅动；②煮沸前应在容器壁上划一刻度，煮沸时随时添补蒸馏水。 3.2 分离用培养基 牛肉汤500ml、牛奶200ml、葡萄糖30g、琼脂18g、水解乳蛋白5g、酵母1g、磷酸氢二钾1g、核糖核 酸0.5g、硫酸镁0.2g、加水定容至1000ml。 3.3 培养基的制备 3.3.1 量取蒸馏水 300 ml，按上述配方加入水解乳蛋、酵母、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、核糖 核酸和琼脂放入容器内加热煮沸溶化后备用； 1 DB63/T 862—2009 3.3.2 量取牛奶 200ml 加热煮沸后取下备用； 3.3.3 将上述溶液和牛肉汤共同放入容器中煮沸后分装于试管中，然后至于 121℃、0.1MPa 条件下灭 菌 30min 后备用。 4 冬虫夏草的采收 4.1 采收时选择虫体饱满、子座短小的冬虫夏草，冬虫夏草外包裹的土（菌）鞘要完好。 4.2 采收的冬虫夏草当天要分离。 5 冬虫夏草真菌分离的环境要求 分离时要将采收到的冬虫夏草带回实验室，在无菌条件下进行。 因路途遥远无法带回时，携带便携式超净工作箱现场进行分离。工作前先将工作环境进行彻底消毒 ， 然后在便携式超净工作箱内进行分离。 6 冬虫夏草真菌的分离步骤 6.1 准备工作 6.1.1 升汞消毒液的配制 准确称取0.1gHgCl2 加少许蒸馏水溶解后用蒸馏水定容至100ml。 6.1.2 消毒灭菌 6.1.2.1 分离工作前用有效氯含量为 1.1％～1.3％的消毒液将分离环境喷雾消毒。 6.1.2.2 将分离用的医用手术刀、医用小剪刀、接种铲、接种针、Ф9cm 培养皿用柔性较好的纸包扎 好后至于 121℃、0.1MPa 条件下灭菌 30min 后取出，放入超净工作台内备用。 6.1.2.3 将已制备灭菌好培养基的试管放入超净工作台内，打开超净工作台内的紫外灯，照射 30 min 后关闭紫外灯的电源。 6.2 将采收回来的冬虫夏草外包裹的土（菌）鞘剥离，然后用毛刷洗净冬虫夏草表面的泥土，用流水 清洗干净。 在超净工作台内将已洗净的冬虫夏草放入升汞消毒液灭菌 5 min 后取出，用无菌蒸馏水冲冼三次 后备用。 6.3 在超净工作台内取一根冬虫夏草放置在无菌的培养皿中，用医用手术刀切去冬虫夏草的外表皮， 选取里面的白色菌丝组织块，将组织块放入另一个无菌的培养皿内切碎至碎粒状。 6.4 在超净工作台内的酒精灯下，用接种铲将碎粒状组织块接种至试管中，盖上棉塞后放入培养箱中 培养。 7 分离后的培养 将接种好的试管放入恒温培养箱中，在18℃条件下培养。 8 菌种鉴定 该菌培养7d后，在接种组织周围出现辐射状沟纹突起；培养10d～15d出现白色细毛状菌丝；30d后 形成灰白色光滑的菌苔，气生菌丝不发达，下面菌丝开始伸入培养基中；60d后形成茸状圆形的菌落； 90d菌落直径可达1.5cm～2.5cm，菌落突起呈馒头状，表面不平，灰白色至棕黄色，菌落坚硬，伸入培 养基中的菌丝呈棕黑色，同时有棕黑色色素向外围扩散，菌丝体具鲜香菇气味；培养120d～150d开始产 生分生孢子。 镜检观察时可见分生孢子顶生、肾形，着生在分生孢子梗顶端，分生孢子颜色为黄褐色。 9 分离时的注意事项 2 DB63/T 862—2009 9.1 冬虫夏草材料选择新鲜、完整。 9.2 表面清洗彻底，消毒时间充分。 9.3 切除冬虫夏草组织块时特别注意，不要触及肠道，一旦触及肠道，就放弃分离。重新选取新的冬 虫夏草进行分离。 9.4 切碎的组织块在试管内分布尽量均匀，不要挤在一起。 3