ICS DB63 备案号：26842-2010 青 海 省 地 方 标 准 DB63/T 863—2009 实验室冬虫夏草真菌--中国被毛孢 真菌保存技术规程 2009-12-07 发布 青海省质量技术监督局 2010-01-10 实施 发布 DB63/T 863—2009 目 次 前言...................................................................................II 1 范围..................................................................................1 2 术语..................................................................................1 3 菌种制备..............................................................................1 3.2 菌种纯化方法........................................................................ 2 4 菌种保存方法..........................................................................2 4.5 冬虫夏草真菌的保存步骤.............................................................. 2 6 保存菌种的复壮........................................................................ 3 I DB63/T 863—2009 前 言 本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。 本规程由青海省畜牧兽医科学院草原所负责起草。 本规程起草人: 李玉玲、马少丽、刘欣、徐海峰、张宗豪。 本规程由青海省质量技术监督局批准发布。 II DB63/T 863—2009 实验室冬虫夏草真菌--中国被毛孢 1 范围 本规程规定了冬虫夏草真菌分离培养后的保存技术措施。 本规程适用于冬虫夏草真菌——中国被毛孢分离培养后的保存。 2 术语 2.1 中国被毛孢（Hirsutella sinensis Liu,Guo,Yu & Zeng） 指冬虫夏草的无性型。 2.2 菌种 冬虫夏草体内分离出中国被毛孢。 2.3 无菌操作 指采用经过一定消毒措施处理之后的环境、器具及人为操作的工作方式。 2.4 培养基 是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质 、 无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。 2.5 菌种纯化 有一种以上的微生物培养物称为混和培养物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞, 那么这个菌落称为纯培养，这个过程就是菌种纯化。 2.6 菌种衰退 菌种在培养或保藏过程中,由于自发突变的存在,出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢 失等现象。 2.7 菌种保藏 就是对活体微生物群体进行有效的保藏的生物学方法。 2.8 水活度(Aw) 是影响干燥菌种保藏稳定性的重要因素。 3 菌种制备 3.1 菌种纯化 3.1.1 纯化菌种用培养基配方 3.1.1.1 牛肉汤的制备 1 DB63/T 863—2009 3.1.1.1.1 先将新鲜牛肉去除筋和脂肪，然后取 1kg 牛肉加蒸馏水 2kg 放入容器内煮沸，煮沸约 40 分钟后将肉渣滤去，肉水经 121℃、0.1MPa 高压灭菌 30min 后备用。 3.1.1.1.2 注意：①煮沸时应边煮边搅动；②煮沸前应在容器壁上划一刻度，煮沸时随时添补蒸馏水。 3.1.1.1.3 固体培养基（1000ml）：牛肉汤 500ml、牛奶 200ml、葡萄糖 30g、琼脂 18g、水解乳蛋白 5g、酵母浸膏 1g、磷酸氢二钾 1g、核糖核酸 0.5g、硫酸镁 0.2g，加水定容至 1000ml。 3.1.1.2 液体培养基：液体培养基配方不加琼脂外，按照本标准 3.1.1.1.3 固体培养基制备方法进行 制备。 3.1.2 培养基的制备 3.1.2.1 固体培养基：按照本标准 3.1.1.1.3 中的配方，依次加入水解乳蛋、酵母、葡萄糖、磷酸氢 二钾、硫酸镁、核糖核酸和琼脂放入容器内加热煮沸溶化后备用；量取牛奶 200ml 加热煮沸后取下备 用；将上述溶液和牛肉汤共同放入容器中加水定容至 1000ml，煮沸后，用 1N 的盐酸或 1N 氢氧化钠调 制 PH 6.7，分装于试管内（中试管每支 6ml～7ml），115℃、0.075MPa 灭菌 30min 后取出摆成斜面备 用。 3.1.2.2 液体培养基：将上述溶液除去琼脂不加，和牛肉汤共同放入容器中煮沸后，用 1N 的盐酸或 1N 氢氧化钠调制 PH 6.7，分装于 250 ml 三角瓶内（每瓶装 150 ml），115℃、0.075MPa 灭菌 30min 后备用。 3.1.3 菌种纯化方法 将实验室分离培养得到的冬虫夏草真菌，经显微镜检查确认为中国被毛孢后，将该菌落边缘挑取少 量菌丝体，接种在纯化用固体培养基上，10℃～15℃条件下培养。待菌丝长满斜面后，再接种到纯化用 液体培养基中，在10℃～15℃、120r/min条件下，每天10小时连续进行震荡培养，待震荡培养至液体中 长出菌丝球后，再次转接到固体培养基中。反复移植2次～3次，即达到菌种纯化。 4 菌种保存方法 4.1 试管继代保存法（斜面低温保藏法） 4.1.1 将长满菌丝的斜面培养基，置 4℃～6℃下保存，保持温度稳定，每 5 个月～6 个月传代一次。 此方法最多只能传代 3 次～4 次，4 代后就失去了活力。 4.1.2 随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，进行剔除。 4.2 试管石蜡液体保存 4.2.1 液体石蜡保藏法：将化学纯液体石蜡经 121℃、0.1MPa 灭菌 30min 后，无菌注入试管斜面培养 物上,使液面高出试管斜面 1cm,试管口塞上胶塞或棉塞,4℃冰箱保藏。使用时,倒去液体石蜡,用无菌 水洗涤斜面菌种 1 次～2 次,进行接种。 4.2.2 将菌种移殖到液体培养基，置 5℃～8℃条件下保存，保持温度稳定。此方法可保存 1.5 年～2 年。 4.3 冷冻真空干燥保存 冷冻真空干燥法的主要步骤为：准备安瓿管→制备脱脂牛奶→制备菌液→分装菌液→预冻→真空干 燥→封管。-70℃冰箱保存，时间可达1 年。 4.4 菌种保存用培养基 4.4.1 土豆汁的制备 取去皮土豆500g，水1000ml，切片煮沸1h，定容至1000ml，取上清液备用。 4.4.2 固体培养基制备 取土豆汁上清液1000ml，分别加入蛋白胨1%、葡萄糖1%、酵母浸膏0.1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁 0.02%、琼脂1.8%～2%。煮沸溶化，用1N的盐酸或1N氢氧化钠调制 PH6.7，后分装于试管内（中试管每 支约6ml～7ml）115℃、0.075MPa灭菌30min后取出，摆成斜面备用。 4.4.3 液体培养基制备 2 DB63/T 863—2009 取土豆汁上清液1000ml，分别加入蛋白胨1%、葡萄糖1%、酵母浸膏0.1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁 0.02%，煮沸溶化，用1N的盐酸或1N氢氧化钠调制 PH 6.7，后分装于250 ml三角瓶内（每瓶装150 ml）。 115℃、0.075MPa灭菌30 min后取出备用。 4.5 冬虫夏草真菌的保存步骤 4.5.1 准备工作 4.5.2 升汞消毒液的配制 准确称取0.1gHgCl2 加少许蒸馏水溶解后用蒸馏水定容至100ml。 4.5.3 消毒灭菌 4.5.3.1 分菌工作前用有效氯含量为 1.1％～1.3％的消毒液将分菌环境喷雾消毒。 4.5.3.2 将分菌用的医用手术刀、医用小剪刀、接种铲、接种针、Ф9cm 培养皿用柔性较好的纸张包 扎好后，至于 121℃、0.1MPa 条件下灭菌 30min 后取出，放入超净工作台内备用。 4.5.3.3 将已制备灭菌好的培养基试管放入超净工作台内，打开超净工作台内的紫外灯，照射 30 min 后关闭紫外灯的电源。 5 菌种转移 5.1 固体培养基转移 按照无菌操作的要求，将纯化好的固体培养基上的菌种，挑取少量菌丝接种在保存用斜面培养基 内，用无菌胶塞封口，10℃～15℃条件下培养。 5.2 液体培养基转移 按照无菌操作的要求，用10 ml的无菌吸管吸取三角瓶内纯化好的菌丝球，接种在保存用液体培养 基内，用胶塞加石蜡封试管口，作为保存菌种备用。 6 保存菌种的复壮 需要使用菌种，复活培养时，需在无菌条件下打开保存的试管，取部分菌种于4.4.2的斜面培养基 上，长出菌落后再转接一次，或者接种到4.4.3的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。进行显微镜 检查，镜检方法见《实验室冬虫夏草真菌——中国被毛孢分离技术规程》。 3