ICS 65.120 B 46 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 1384.6—2011 饲料中泰乐菌素的测定 Determination of tylosin in feed 2011 - 05 - 10 发布 河北省质量技术监督局 2011 - 05 - 20 实施 发 布 DB13/T 1384.6—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、石家庄市疾病预防控制中心、北京出入境检验 检疫技术中心、河北医科大学、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、张宏、李挥、丛斌、杨立学、卢晓宇、吕品、贾茜、李志平、马春玲、 米振杰、沈磊、范斌、高振同、武英利。 I DB13/T 1384.6—2011 饲料中泰乐菌素的测定 1 范围 本标准规定了饲料中泰乐菌素的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中泰乐菌素的测定。 本标准的方法检出限为1.0 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neq ISO 3696:1987) 3 原理 试样用碱性溶液溶解后，用固相萃取柱萃取，洗脱液浓缩后用甲醇溶液定容，液相色谱-串联质谱 仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 水：应符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2 甲醇：HPLC 级。 4.3 二氯甲烷：分析纯。 4.4 乙酸钠：分析纯。 4.5 甲醇+水(2＋8)（V/V）：量取 20 mL 甲醇与 80 mL 水混合。 4.6 固相萃取柱：HLB 或相当者,200 mg，3 mL。 4.7 泰乐菌素标准品：纯度≥95％。 4.8 泰乐菌素标准储备溶液：1.0 mg/mL。准确称取适量的泰乐菌素标准物质（4.7），用甲醇配成 1.0 mg/mL 的标准储备液。储备液贮存在 4℃冰箱中，可使用两个月。 4.9 泰乐菌素标准工作溶液：用空白样品提取液分别配成泰乐菌素浓度为 2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、 10.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、200.0 ng/mL 标准工作溶液。标准工作溶液在 4℃保存，可 使用一周。 4.10 乙酸钠缓冲液（pH＝5.5，0.15 mol/L）：称取 12.30 g 醋酸钠于 1 000 mL 量瓶中，加 900 mL 水，使溶解，调节 pH 至 5.5，用水定容。 5 仪器 1 DB13/T 1384.6—2011 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 分析天平：感量 0.l mg 和 0.0l g 各一台。 氮吹仪。 旋涡混匀器。 离心管：100 mL。 高速离心机。 滤膜过滤器：0.45 μm，有机相。 刻度离心管：10 mL。 试样的制备 提取 准确称取 5 g 样品（精确至 0.01 g）于 100 mL 离心管中，加入 30 mL 二氯甲烷于旋涡混匀器上快 速混匀 10 mim,5 000 r/min 离心 5 min。将上清液移至 20 mL 试管中，氮吹仪吹至近干，加 1 mL 甲醇 溶解残渣，再加入乙酸钠缓冲溶液 4 mL,轻轻摇匀，在离心管中加入 5 mL 正己烷，轻轻摇匀，于 5 000 r/min 离心 5 min,使分层，取水相待净化。 6.2 净化 将水相移入 OasisHLB 柱器（使用前分别用 3 mL 甲醇和 5 mL 水预处理，保持柱体湿润）中，以不 高于 2 mL/min 的流速过柱，待溶液完全流出后，用 5 mL 水洗离心管和贮液管并过柱,然后再用 5 mL 甲醇＋水（20＋80）洗柱，弃去全部淋出液。在 65 kPa 的负压下，减压抽干 10 min，最后用 5 mL 甲 醇洗脱，收集洗脱液于 10 mL 刻度离心管中，于 50℃氮吹仪吹干，用甲醇＋水（30＋70）定容至 1.0 mL， 过 0.45 μm 的滤膜到进样瓶中，供液相色谱－质谱仪测定。 7 7.1 测定步骤 测定 7.1.1 液相色谱条件 色谱柱：C18，5 μm，150 mm × 2.1 mm（内径）或相当者。 流动相：水（A）+甲醇（B）。 流速：0.25 mL/min。 梯度：0 min～5.0 min 20％～90％B，5.0 min～7.0 min 90％B，7.1 min～9.0 min 20％B。 柱温：30℃。 进样量：25 μL。 7.1.2 串联质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子监测。 扫描方式：多反映检测（MRM）。 雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气。 电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。 定性离子对(m/z)：916.5/174，916.5/772.5。 2 DB13/T 1384.6—2011 定量离子对(m/z)：916.5/174。 7.2 液相色谱－串联质谱测定 泰乐菌素标准工作溶液在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以样品峰面积为纵坐标，工作 溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制 6 点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中 泰乐菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。泰乐菌素标准物质质谱图参见附录 A。 7.3 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 8 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式(1)计算，计算结果需扣除空白值： X = c• V m ........................................................... (1) 式中： X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）。 c——从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。 V——样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)。 m——样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15％。 3 DB13/T 1384.6—2011 AA 附 录 A （资料性附录） 标准物质总离子流图及质谱图 图A.1 泰乐菌素总离子流图及质谱图 _________________________________ 4