ICS 65.120 B 46 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 1384.9—2011 饲料中伊维菌素的测定 Determination of tylosin in feed 2011 - 05 - 10 发布 河北省质量技术监督局 2011 - 05 - 20 实施 发 布 DB13/T 1384.9—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、石家庄市疾病预防控制中心、河北医科大学、 北京出入境检验检疫技术中心、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、张宏、李挥、丛斌、卢晓宇、吕品、杨立学、李志平、贾茜、马春玲、 米振杰、张敬轩、沈磊、高振同、武英利。 I DB13/T 1384.9—2011 饲料中伊维菌素的测定 1 范围 本标准规定了饲料中伊维菌素的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中伊维菌素的测定。 本标准的方法检出限为10 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682－1992，neq ISO 3696:1987) 3 原理 试样中的伊维菌素，采用丙酮-水提取。提取液经用异辛烷进行液-液分配使被测物进入异辛烷层。 浓缩，用正己烷与乙腈浸出，并进行第二次液-液分配使被测物进入乙腈层。浓缩，加水，使成水溶液。 水溶液再经 Sep－Pak 小柱净化，用乙腈洗脱。洗脱液经蒸干，甲醇浸出并定容，溶液经液相色谱-串联 质谱定性定量检测。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 丙酮：经高锰酸钾回流 l h，重蒸馏。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 异辛烷：重蒸馏。 4.4 正己烧：经氧化铝层析柱净化后，重蒸馏。 4.5 甲醇：色谱纯。 4.6 丙酮-水（1+1）。 4.7 乙腈-水（1+1）。 4.8 C18Se－Pak 小柱，或相当者：使用前用水进行预处理。 4.9 伊维菌素标准品：纯度≥97％。 4.10 伊维菌素标准储备液：准确称取 0.1 g（准确至 0.000 l g）的伊维菌素标准品于 100 mL 容量瓶中，用少量的甲醇溶解，然后再用甲醇稀释至刻度，混匀。配制成伊维菌素浓度为 1.0 mg/mL 的标准储备液。 4.11 伊维菌素标准工作液：根据需要，准确移取适量标准储备液，用甲醇稀释成适当浓度的标准 工作液，标准工作液需每周配制一次。 4.12 甲酸。 1 DB13/T 1384.9—2011 4.13 0.1％甲酸水溶液：准确量取 1 mL 甲酸至 1 000 mL 容量瓶中，用水定容，混匀即可。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 电子天平：感量精确至 0.01 g。 离心管：50 mL。 离心机。 旋转蒸发器。 超声波浴。 旋涡混匀器。 测定步骤 6.1 提取 称取约 5 g（精确至 0.0l g）试样于烧杯中，加入 10 mL 丙酮-水（1+1），旋涡混匀 2 min。移至 50 mL 离心管中，用 20 mL 异辛烷洗涤烧杯，合并入离心管中。旋涡混匀 1 min，于 5 000 r/min 离心 10 min，取异辛烷层氮吹至 2 mL。 6.2 净化 取上述浓缩液加入 8 mL 正己烷和 10 mL 乙腈，于超声波浴中超声振摇 5 min。移至 50 mL 离心管 中，于 5 000 r/min 离心 5 min。移乙腈层于 50 mL 离心管中。再用 10 mL 乙腈提取一次，离心 5 min， 合并乙腈层。加入 20 mL 水，于 60℃旋转蒸发浓缩至约 6 mL，加入 6 mL 水。 取上述溶液缓慢注入经预处理过的 C18Sep－Pak 小柱中，弃去流出液，减压干燥。用 3×5 mL 乙腈 洗脱，收集洗脱液于具塞刻度离心管中。氮气吹干，用 1.0 mL 甲醇－乙腈－水溶液（9+9+2）溶解， 待测。 6.3 6.3.1 测定 液相色谱-串联质谱条件 色谱柱：C18，5 μm，150 mm×4.6 mm（内径）或相当者。 流动相：甲醇（A）+0.1% 甲酸水溶液（B）。 流速：0.8 mL/min。 梯度：见表 1。 柱温：40℃。 进样量：20 μL。 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：负离子扫描。 检测方式：多反应监测。 电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。 定性离子对(m/z)：897.4/753.1，897.4/609.1。 定量离子对(m/z)：897.4/753.1。 2 DB13/T 1384.9—2011 表1 6.3.2 梯度洗脱程序 时间（min） A（％） B（％） 0 60 40 1.00 60 40 2.00 90 10 11.00 95 5 11.10 10 90 12.50 10 90 12.60 60 40 15.00 60 60 色谱测定 根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液 中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。伊维菌素标准品多反应监测（MRM）色谱图见附录 A。 6.4 定性、定量 按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品 一致，定量测定时采用标准曲线法。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允 许偏差不超过表 2 规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表2 6.5 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/(％) ＞50 ＞20 至 50 ＞10 至 20 ≤10 允许的相对偏差/(％) ±20 ±25 ±30 ±50 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 7 结果计算和表述 用色谱数据处理机或用标准曲线按式（1）计算试样中伊维菌素含量： X= c× V ……………………………………….(1) m ×1000 式中： X 一一试样中伊维菌素的量，单位为毫克每千克（mg/kg）。 c 一一从标准曲线上得到的待测液中伊维菌素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。 V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）。 m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。 3 DB13/T 1384.9—2011 AA 附 录 A （资料性附录） MRM 色谱图 图A.1 伊维菌素的 MRM 色谱图 _________________________________ 4