ICS 65.120 B 46 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 1384.4—2011 饲料中新霉素的测定 Determination of neomycin in feed 2011 - 05 - 10 发布 河北省质量技术监督局 2011 - 05 - 20 实施 发 布 DB13/T 1384.4—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、石家庄市疾病预防控制中心、北京出入境检验 检疫技术中心、河北医科大学、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、张宏、李挥、杨立学、丛斌、卢晓宇、吕品、李志平、沈磊、贾茜、马 春玲、米振杰、李强、高振同、武英利。 I DB13/T 1384.4—2011 饲料中新霉素的测定 1 范围 本标准规定了饲料中新霉素的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中新霉素的测定。 本标准的方法检出限为40 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682－1992，neq ISO 3696:1987) 3 原理 试样经提取，高速离心后再用 CBX 固相萃取小柱净化，液相色谱串联质谱测定，子离子丰度比定 性，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 七氟丁酸酐（HFBA）：优级纯。 4.3 三氯乙酸。 4.4 磷酸二氢钾（KH2PO4）。 4.5 盐酸。 4.6 二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2 H2O）。 4.7 样品提取液（10 mmol/L KH2PO4 溶液，含 0.4 mmol/L EDTA 和 2％三氯乙酸）：准确称量 1.36 g KH2PO4 于 1 000 mL 容量瓶中，加入少量水，用盐酸调 pH 至 4.0，再加入 1.5 g Na2EDTA·2 H2O 和 20 g 三氯乙酸，用水定容至刻度，混匀即得。 4.8 氢氧化钠 4.9 新霉素标准品：纯度≥99％。。 4.10 新霉素标准储备溶液：分别称取经折算相当于 0.010 0 g 新霉素的标准品，用水溶解定容至 100 mL，溶液浓度为 100 g/mL。1℃～4℃冷藏保存，保存期 1 个月。 4.11 空白样品提取液：用不含链霉素的样品，按照 6.1 和 6.2 制备空白样品溶液。 4.12 新霉素标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成 15 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、300 ng/mL 的混合标准工作溶液，相当于样品中含有 6 g/kg、10 g/kg、20 g/kg、 100 g/kg、120 g/kg 新霉素，现配。 1 DB13/T 1384.4—2011 4.13 CBX 阳离子交换柱，或相当者：500 mg，6 mL。 4.14 乙酸。 4.15 10％乙酸甲醇溶液：准确量取 10 mL 乙酸于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀即可。 4.16 100 mmol/L HFBA 水溶液：准确量取 6.5 mL 七氟丁酸酐，用水稀释至 500 mL（4℃避光保存 6 个月）。 4.17 20 mmol/L HFBA 水溶液：准确量取 100 mmol/L HFBA 溶液 50 mL，用水稀释至 250 mL（4℃ 避光保存 6 个月）。 4.18 5 mmol/L HFBA 水溶液：准确量取 20 mmol/L HFBA 溶液 25 mL，用水稀释至 100 mL（4℃避 光保存 6 个月）。 4.19 20 mmol/LHFBA 乙腈溶液：准确量取 1.3 mL 七氟丁酸酐，用乙腈稀释至 500 mL（4℃避光保 存 6 个月）。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 6 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 微孔滤膜。 pH 计。 高速离心机。 旋涡混匀器。 固相萃取装置。 测定步骤 6.1 提取 准确称取样品 1 g（精确到 0.01 g）至 10 mL 离心管中，加样品提取液 10 mL，旋涡混匀 10 min， 12 000 r/min 离心 10 min，移出上清液。重复提取一次，合并上清液，调 pH 至 8.0，12 000 r/min 离 心 10 min，取上清液备用。 6.2 净化 将上清液移入 CBX 柱（使用前分别用 5 mL 甲醇、5 mL 水预处理，保持柱体湿润）。溶液以 2.0 mL /min 的流速过柱，然后依次用水淋洗，减压抽干 20 min。用 10％乙酸甲醇溶液 5 mL 洗脱，收集洗脱液 于 40℃下氮气吹干。用 5 mmol/L HFBA 水溶液 0.5 mL 溶解残渣，15 000 r /min 离心 10 min，经 0.22 μm 滤膜过滤后，待测。 6.3 测定 6.3.1 液相色谱-串联质谱条件 色谱柱：C18，5 μm，50 mm×2.l mm（内径）或相当者。 流动相：20 mmol/L HFBA 水溶液（A）＋20 mmol/L HFBA 乙腈溶液（B）。 流速：0.25 mL/min。 梯度：0 min～10.0 min 5％～60％ B，10.0 min～10.1 min 60%～5% B，10.1 min～15.0 min 5％ B。 柱温：30℃。 2 DB13/T 1384.4—2011 进样量：10 μL。 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测。 电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。 定性离子对(m/z)：615.6/160.9，615.6/293.1。 定量离子对(m/z)：615.6/160.9。 6.3.2 色谱测定 根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液 中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。新霉素标准品多反应监测（MRM）色谱图参见附录 A。 6.4 定性、定量 按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品 一致，定量测定时采用标准曲线法。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允 许偏差不超过表 1 规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表1 6.5 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/(％) ＞50 ＞20 至 50 ＞10 至 20 ≤10 允许的相对偏差/(％) ±20 ±25 ±30 ±50 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 7 结果计算和表述 用色谱数据处理机或用标准曲线按式（1）计算试样中新霉素含量： X= c×V m × 1000 ……………………………………….(1) 式中： X 一一试样中新霉索的量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c 一一从标准曲线上得到的待测液中新霉素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15％。 3 DB13/T 1384.4—2011 AA 附 录 A （资料性附录） MRM 色谱图 图A.1 新霉素的 MRM 色谱图 _________________________________ 4