DB63 ICS 点击此处添加 ICS 号 点击此处添加中国标准文献分类号 青 海 省 地 方 标 准 DB 63/T 1041—2011 大通牦牛细管冷冻精液 2011 - 12 - 19 发布 青海省质量技术监督局 2012 - 02 - 01 实施 发 布 DB63/ T 1041—2011 前 言 本标准编写符合GB/T1.1—2009的要求。 本标准由青海省农牧厅提出并归口。 本标准起草单位：青海省大通种牛场。 本规范起草人：冯宇诚、殷满财、才加、武甫德、孙延生。 I DB63/ T 1041—2011 大通牦牛细管冷冻精液 1 范围 本标准规定了大通牦牛细管冷冻精液的制作、规格、质量、检查方法及包装标记、储存、运输等。 本标准适用于大通牦牛细管冷冻精液的制作、科研及教学。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY 1658 大通牦牛 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 采精 用人工模拟且有自然交配感的工具，以获得公牛精液的方法。 3.2 细管 为无毒、耐低温的专用塑料管。 3.3 细管冷冻精液 将精液用稀释液等温稀释、平衡后，分装入细管并封口，然后在液氮（-196 ℃）中快速冷冻。 3.4 大通牦牛 由中国农科院兰州畜牧与兽药研究所、青海省大通种牛场利用野牦牛作为父本，通过与家牦牛杂交， 而培育出的牦牛新品种。 4 技术要求 4.1 采精种公牛 1 DB63/ T 1041—2011 应符合NY 1658规定的特等或一等大通牦牛公牛，体质健康，不允许有已发布的动物防疫法中所明 确的二类疫病中的任何一种病。 4.2 新鲜精液质量 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 呈乳白色或微黄色。 直线前进运动的精子≥60％。 8 精子密度≥6x10 /ml。 精子畸形率≤12％。 细管 4.3.1 细管外观 细管无裂痕，两端封口严密，印制的标志应清晰。 4.3.2 细管剂量、剂型 中型0.5 ml；微型0.25 ml。 4.4 解冻每一剂量的细管冷冻精液 4.4.1 精子活力 ≥0.3（指呈直线前进运动的精子百分率为30%）。 4.4.2 直线前进运动的精子数 ≥800万个。 4.4.3 精子畸形率 ≤20%。 4.4.4 细菌数 ≤800个。 4.4.5 精子存活时间 在５ ℃～８ ℃储存时下限为12 h，在20 ℃储存时下限为6 h。 5 冷冻精液的制作 5.1 采精准备 5.1.1 在牦牛配种季节（7 月～10 月）进行采精。采精场所保持安静，地面保持清洁卫生并铺垫防滑 设施。 5.1.2 选择性情温顺、无疫病的母牛作台牛，并保定于采精架内。台牛的外阴、臀部和公牛体表及包 皮内腔采精前用清水冲洗干净。 5.1.3 假阴道润滑剂（凡比士林与液体石蜡油按 1:1 的例调制）用水浴煮沸消毒。 2 DB63/ T 1041—2011 5.1.4 安装假阴道前应洗净双手，用 75 %的酒精棉球消毒假阴道内胎及三角漏斗，将三角漏斗安装于 假阴道上，接上集精管，套上保护套，假阴道内可提前注人 38 ℃左右温水，并用消毒纱布将假阴道口 包裹好，放置于预先调整好温度 44 ℃～46 ℃的恒温箱内待用。采精前在假阴道内胎的前 2/3 处用涂 抹棒均匀涂擦适量消毒过的润滑剂，并从活塞孔打气，使假阴道有适度（假阴道口呈三角形状为宜）的 压力。采精时温度控制在 38 ℃～42 ℃之间。 5.2 采精方法 采精时饲养员与采精员要积极配合。采精员的动作要迅速而正确，胆大心细，注意人、畜安全。采 精前先让公牛进行数次空爬使之有充分的性准备，待公牛性欲旺盛时采精。采精员右手持假阴道站在公 牛右后方，当公牛起跳前肢爬上台牛时，迅速向前用左手托着公牛包皮，右手持假阴道与台牛成40°角， 阴道口斜向下方，左右手配合将公牛阴茎自然地引人假阴道口内（不得用手捉拿阴茎、假阴道去套阴茎）， 公牛往前一冲即完成射精动作，公牛随即而下，采精员右手紧握假阴道，随公牛阴茎而下，待公牛前肢 落地时，缓慢地把假阴道脱出，立即将假阴道口斜向上方，打开活塞放气，使精液尽快地流人集精管内， 然后小心地取下集精管，迅速送至精液处理室。安装好的假阴道只能使用一次，不得重复使用。成年公 牛每周采精两次，每次可连续采精两回（间隔30 min左右）。 5.3 新鲜精液质量检查 按本标准4.2要求判定。 5.4 精液处理 5.4.1 精液稀释液配制 5.4.1.1 卡苏牛用无菌无卵黄稀释液（法国进口，250 毫升/瓶） 先将1000 ml超纯水倒入量杯并放进水浴锅中（水浴锅温度为32 ℃～34 ℃），同时把瓶装卡苏牛 用无菌无卵黄稀释液原液也放入水浴锅中，置15 min。取1瓶原液（250 ml）倒入1000 ml超纯水中稀释， 再用稀释液将原液瓶冲洗两遍，配成1250 ml稀释液即可使用。 5.4.1.2 常规冻精稀释液 5.4.1.2.1 5.4.1.2.2 5.4.2 第一液 第二液 蒸馏水 100 ml，柠檬酸钠 2.97 g，卵黄 10 ml。 取第一液 41.75 ml，加入果糖 2.5 g，甘油 7 ml。 精液稀释操作 5.4.2.1 准备 凡接触精液的器皿消毒（洗净干燥）后放在30 ℃～35 ℃恒温箱中，稀释液放在34 ℃恒温水浴箱 中备用。盛装稀释精液的容器，应做明显标记，以防混淆。 5.4.2.2 密度测定 5.4.2.2.1 采集的新鲜精液通过专用窗口传递入精液处理室，及时记录牛号、采精量等有关数据，按 精液密度测定仪的操作规程准确进行精液的密度测定。 5.4.2.2.2 测出密度后通过计算或精液密度测定仪的相关程序获得应加稀释量、可制作细管数等信息。 及时记录牛号、密度、所加稀释液量、制作细管数等有关数据。 5.4.2.3 镜检精子活力 3 DB63/ T 1041—2011 取原精或稀释精液一滴于载玻片上，加盖盖破片后在有恒温（38 ℃）装置的显微镜下估测评定活 力。镜检活力合格者进行稀释。 5.4.2.4 精液稀释平衡 5.4.2.4.1 卡苏牛用无菌无卵黄稀释液稀释后的平衡方法 将水浴锅中的精液（温度32 ℃～34 ℃）用配好的稀释液进行1：1的稀释，然后朝一个方向摇匀。 将稀释过的精液放入32 ℃～34 ℃水浴锅中置10 min。再加入最终测量出的稀释总量，以缓慢的速度摇 匀。再在4 ℃温度中平衡3 h～5 h。 5.4.2.4.2 常规稀释液稀释后的平衡方法 将所加稀释液分为二次添加，首先加入不含甘油的第一液，加至稀释总量的一半，降温、平衡后再 加足含有甘油的第二液。 5.4.3 5.4.3.1 精液冷冻 封装 用牛精液四头灌封机通过计算机程序控制设备的运转，使之自动、准确地把精液灌装到细管中，并 封存、打印标识。 5.4.3.2 上架 平衡、封装后的细管精液上架码放时应注意细管摆放的方向，把棉塞封口端靠近操作者，超声波封 口端远离操作者，入冷冻仪时亦应如此放置。每架上放一根类似于细管的标记物，一头牛用同一颜色的 标记物，便于识别。如同一架上有不同牛的细管精液，要分开码放，两头牛之间要隔开一些距离，以免 混淆。 5.4.3.3 冷冻 5.4.3.3.1 全自动冷冻仪 冷冻仪是由电子计算机控制的全自动冷冻容器，可根据使用者的需要获取多条冷冻曲线。使用时首 先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4 ℃，关闭风扇电源，待风扇 完全停止后方可把已排满待冻细管的架子（每15架重叠在一起）放入冷冻仪。操作要迅速，冷冻仪与低 温柜应尽量靠近。由电脑按预选的最佳冷冻曲线自动完成冷冻过程。如果所排细管不够30架，应用空架 补充满30，以获得最佳的冷冻效果。 5.4.3.3.2 自制的冷冻箱 如用自制的冷冻槽作冷冻器时，槽的深度应在50 cm以上。温度值控制在-140 ℃左右，初冻温度调 节至-120 ℃左右，冷冻时温度回升的最高值不得高于-90 ℃，整个冷冻过程控制在8 min之内，此间所 指的冷冻温度是细管冷冻面的温度而非细管内的温度。 5.4.3.4 收集 冷冻完后打开盖子，冻精按牛号投入盛满液氮的不同的提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞端 向下，切不可倒置，并迅速浸泡在液氮中，液氮罐入临时贮存库。 4 DB63/ T 1041—2011 6 冷冻精液的检验方法 6.1 解冻 取细管冷冻精液投入到38 ℃～40 ℃温水中直接解冻，然后取一滴压片镜检。 6.2 镜检 取解冻后的精液一滴于载玻片上，加盖盖破片后在有恒温（38 ℃）装置的显微镜下估测评定活力。 镜检活力合格者进行包装。 7 细管冷冻精液包装 用细管计数分装机进行包装，包装应在-140 ℃以下的环境中进行，包装后的细管其棉塞端在塑料 管的底部，不得倒置。塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、底部小的塑料管。按公牛品种、 牛号放入液氮容器内储存。 8 细管冷冻精液标记 8.1 每头公牛、每批冻精均应分别包装，细管和盛颗粒冻精的盛器外面均注明种牛品种、牛号、制作 日期和制作单位、数量及活力的标记。 8.2 大通牦牛：冻精容器（袋）及标签颜色为蓝色，代号 DT。 9 细管冷冻精液储存 细管冷冻精液应储存于液氮罐的液氮中，设专人保管，每周定时加一次液氮，应经常检查液氮罐的 状况，如发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其他液氮罐内保存。取放细管冷冻精液时提漏按号 扣入定位槽内，提漏只准提升到容器颈下，不得提到容器外，提漏离开液氮面不得超过10 s。 10 运输 运输冻精时，应有专人负责，办好交接手续，途中应及时检查和补充冷源。 _________________________________ 5