ICS 65.020.20 B 05 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 1420—2011 马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程 Technological rules for detecting fungicide resistance in Phytophthora infestans on potato 2011 - 07 - 07 发布 河北省质量技术监督局 2011 - 07 - 17 实施 发 布 DB13/ T 1420—2011 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准河北省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：河北省农林科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：王文桥、张小风、马志强、韩秀英、孟润杰、赵建江。 I DB13/ T 1420—2011 马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯晚疫病菌抗药性检测的术语和定义及检测方法。 本标准适用于马铃薯晚疫病菌对杀菌剂的抗性检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 抗药性 fungicide resistance 一种杀菌剂当用其标签推荐的剂量防治作物病害时，即使重复试验也无法达到所期望的防治效果， 该靶标病菌群体的敏感性下降的遗传变化称为抗药性。 2.2 敏感基线 sensitivity baseline： 在同类作用方式的杀菌剂使用之前，靶标病菌群体中不同菌株对一种药剂的敏感性(EC50 值)分布曲 线，常用平均值及 95%置信限表示。 2.3 敏感型 sensitivity type： 根据菌株对药剂的敏感性(EC50 值)或抗性水平，或在区分剂量下药剂对菌株的抑制程度，将菌株划 分成敏感、低抗、中抗、高抗等不同类型。 2.4 菌丝生长速率法 马铃薯晚疫病菌菌丝体在含药培养基平板上培养而生长受到抑制的毒力测定方法，适用于检测马铃 薯晚疫病菌对能显著抑制其菌丝生长的苯基酰胺类、QoI 类、羧酸酰胺类、乙酰胺类、氨基甲酸酯类、 苯甲酰胺类等杀菌剂的抗药性。 2.5 叶盘漂浮法 马铃薯晚疫病菌孢子囊接触漂浮于药液上的叶盘背面而萌发受到抑制的毒力测定方法，适用于马 铃薯晚疫病菌对具有内吸性的苯基酰胺类、QoI 类、羧酸酰胺类、乙酰胺类、氨基甲酸酯类、苯甲酰胺 类等杀菌剂的抗药性检测。 3 测定方法 3.1 菌丝生长速率法 适用于检测马铃薯晚疫病菌对能明显抑制其菌丝生长的甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵、嘧菌酯、吡唑 醚菌酯、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜脲氰、霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺、代森锰锌、 百菌清及其混剂的抗性。 1 DB13/ T 1420—2011 3.1.1 供试菌株的采集、分离及保存 田间采集感染晚疫病的马铃薯新鲜叶片，夹入洗净蘸干的马铃薯块茎中，做好标记，带回实验室， 16~18℃培养 2～3 d。在无菌条件下，将块茎上霉状物用接种针挑至含 100 µg/mL 氨苄青霉素、20 µg/mL 利福平及 100 µg/mL 五氯硝基苯的黑麦琼脂培养基(Rye agar, RA)平板上，18~20℃培养 4~5 d，将未受 杂菌污染的菌丝转接到新的 RA 平板上，18~20℃培养 7～10 d 后转至试管中 RA 斜面上，培养至菌丝长 满，在 10℃条件下保存，每 3 个月转接 1 次。 3.1.2 供试药剂的收集及保存 收集杀菌剂原药，保存于避光、低温（0-4℃）及干燥条件下。 3.1.3 含药培养基的制作 称取适量的原药，用有机溶剂（如丙酮、二甲亚砜等）溶解，以无菌水稀释成母液（丙酮含量应低 于总体积的 1%），再加入无菌水稀释成系列浓度的药液，按照药液与培养基体积比 1:9 分别加入溶化 的 RA 中，混匀，泼碟，配制成含不同浓度药剂的 RA 平板。对照仅加入适量 DMSO 或丙酮等溶剂。 3.1.4 接种及培养 将菌株在 RA 平板上培养 10 d，从菌落边缘以直径 0.5 cm 打孔器打菌饼，用接种针挑取菌饼接在 含药 RA 平板（直径 9 cm) 中央，以不含药 RA 平板为对照，每皿接 1 个菌饼，每处理重复 3 次。盖上 皿盖， 18-20℃培养 10 d。 3.1.5 结果检查 待对照菌落长至直径约 7 cm 后，用直尺十字交叉测量菌落直径(cm)2 次，计算平均值。 3.1.6 数据统计和分析 按下式计算各处理（不同浓度的药剂）对菌丝生长的抑制率，结果保留到小数点后两位。 P= D0 − D1 ×100…………………………………………………(1) D0 − 0.5 式中：P 为抑制率（％）；D0 为对照菌落直径（cm）；D1 为处理菌落直径（cm）。 采用 SAS、DPS 等统计软件，进行药剂浓度对数值（X）与抑制率的几率值（Y）之间的线性回归分析，求出每种药 剂对每个菌株的毒力回归方程式（Y=a+bX）、相关系数和置信限。由毒力回归方程式求出菌株对药剂的敏感性(EC50 值)。 3.1.7 敏感基线(EC50)的建立 从未使用过某种药剂及其相同作用机理药剂的地区采集分离约 100 株马铃薯晚疫病菌，测其对该药 的敏感性(EC50 值)。将供试菌株对某种药剂的敏感性(EC50 值)划分成不同区段（一般 5 个区段），确定 敏感性分布范围（例如从较小的 a 到较大的 b)，写出浓度区段（等差数列）a,a+（b-a）/n, a+2（b-a）/n, a+3（b-a）/n, a+4（b-a）/n,……,a+(k-1) ×（b-a）/n（n 为区段数，k 为数列的序数），以每个区段菌株 出现频率（%）为纵轴，以药剂浓度区段为横轴，画出敏感性分布光滑曲线图，由 n 个点连成，每一点 以(x,y)来表示，x=浓度区段中值，y 代表该区段菌株出现频率。利用 DPS、SPSS 等统计软件进行敏感 性数据正态性分布检验，如果 Ρ 值>0.05，即在 95%置信限内，敏感性呈近似正态分布，则菌株可视为 野生敏感菌株，其敏感性(EC50 值)平均值可作为敏感基线(EC50 值)，计算结果保留 3 位有效数字。基线 数据参照附录 A。 2 DB13/ T 1420—2011 3.1.8 抗性水平评估 抗性水平＝ 敏感性（ EC50值） ×100． ．． ． ．． ．． ．． ．． ．． ． ．． ．． ．． ．．（２） 敏感基线（ EC50值） 计算结果保留整数。 3.1.9 菌株敏感型划分 菌株对甲霜灵（或精甲霜灵）敏感型：高抗菌株：在含 5 µg/mL、100 µg/mL 甲霜灵（或精甲霜灵） 的 RA 平板上菌落直径≥对照菌落直径的 40﹪；中抗菌株：在含 5 µg/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的 RA 平板上菌落直径＞40%对照菌落直径，在含 100 µg/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的 RA 平板上菌落直径＜ 对照菌落直径的 40%；敏感菌株：在含 5 µg/mL、100 µg/mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的 RA 平板上菌落 直径均＜对照菌落直径的 40﹪。 菌株对嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁霜灵等高度固有抗性风险药剂的敏感型：敏感菌株（S），敏感性 （EC50 值）≤敏感基线的 95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基线的 95%置信限上限/敏感基线)；低抗 菌株（LR），(敏感基线的 95%置信限上限/敏感基线)<抗性水平≤100 倍；中抗菌株（MR） ，100 倍<抗 性水平≤500 倍；高抗菌株（HR），抗性水平>500 倍。 菌株对霜脲氰、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜霉威、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺等中低度固 有抗性风险药剂的敏感型：敏感菌株（S），敏感性（EC50 值）≤敏感基线的 95%置信限上限，抗性水 平≤(敏感基线的 95%置信限上限/敏感基线)；低抗菌株（LR） ，(敏感基线的 95%置信限上限/敏感基线)< 抗性水平≤10 倍；中抗菌株（MR），10 倍<抗性水平≤100 倍；高抗菌株（HR），抗性水平>100 倍。 3.1.10 抗性频率评估 抗性频率（%）= 抗性菌株数 ×100……………………………………（3） 供试菌株数 计算结果保留至小数点后一位。 3.1.11 检测报告的编写 根据统计结果、抗性水平及抗性频率评估，写出正式抗性检测报告，并列出原始数据。 3.2 叶盘漂浮法 适用于检测马铃薯晚疫病菌对甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉、氟吗 啉、双炔酰菌胺、霜脲氰、霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺等内吸杀菌剂及其混剂的抗性。 3.2.1 供试菌株的采集、分离及保存 同 3.1.1 3.2.2 孢子囊悬浮液的配制 将保存在试管中 RA 斜面上的菌株转接至薯片上培养，将霉状物用适量无菌水冲洗，或将适量无菌 水加入培养菌株 10～15 d 的 RA 平板上，用刮板刮取菌落中的孢子囊，用 2 层纱布过滤，离心，以无 菌水稀释，制备 5×104 孢子囊/mL 的孢子囊悬浮液，4℃保存 2.5 h，备用。 3.2.3 供试药剂的收集、保存及配制 收集甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺、霜脲氰、 3 DB13/ T 1420—2011 霜霉威、氟吡菌胺、氰霜唑、氟啶胺等杀菌剂原药。保存在避光、低温（0-4℃）干燥条件下。实验时， 称取适量的原药，加入少量丙酮或二甲亚砜（DMSO）等有机溶剂溶解，再加入无菌水稀释成母液，将 母液以无菌水稀释成系列浓度的药液。 3.2.4 供试植株 在花盆中或日光温室土壤中种植马铃薯感病品种（费乌瑞它、夏坡蒂等），待长至 7-8 片复叶时， 取叶片用打孔器打成直径 1.5 cm 叶盘待用。 3.2.5 接种及培养 每个直径 9 cm 的培养皿中加入 20 mL 药液（对照加蒸馏水），每浓度 1 皿，将 15 片叶盘背面向上 漂浮在液面上。用微量移液器在每叶盘背面点接 1 滴 10 μL 的孢子囊悬浮液。在每天光照 16 h 18～20℃ 的条件下培养 4～5 d。 3.2.6 调查发病 待对照充分发病后调查每片叶盘产孢情况。根据产孢面积占叶盘面积的百分率划分病级： 0 级，无病；1 级，1%～5%；3 级，6%～10%；5 级，11%～20%；7 级，21%～50%；9 级，＞50%。 3.2.7 数据统计和分析 按下式计算各处理病情指数和相对防效，结果保留到小数点后两位。 病情指数＝ ∑ (病叶盘数 × 相应病级数） ×100………………………………………….(4) 总叶盘数 × 最大病级数 相对防效（%）＝ 对照病情指数− 处理病情指数 ×100……………………..(5) 对照病情指数 按照 3.1.