ICS 65.120 B 46 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 1384.1—2011 饲料中 4 种β－内酰胺类药物的测定 Determination of four kinds of β-lactams in feed 2011 - 05 - 10 发布 河北省质量技术监督局 2011 - 05 - 20 实施 发 布 DB13/T 1384.1—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北大学、河北省食品质量监督检验研究院、河北医科大学、北京出入境检验检 疫局技术中心、石家庄市疾病预防控制中心、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、李挥、吕品、丛斌、卢晓宇、张敬轩、沈磊、米振杰、贾茜、张宏、杨 立学、李志平、高振同、武英利。 I DB13/T 1384.1—2011 饲料中 4 种β－内酰胺类药物的测定 1 范围 本标准规定了饲料中青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林 4 种β-内酰胺类药物的液相色谱串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林的测定。 本标准的方法检出限：青霉素G、青霉素V为1.0 μg/kg；氨苄西林、阿莫西林为2.0 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 试样中的 4 种 β-内酰胺类药物残留，用 Oasis HLB 或相当的固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱 仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 乙酸：优级纯。 4.4 乙腈+水（1＋3）：量取 25 mL 乙腈与 75 mL 水混匀。 4.5 Oasis HLB 固相萃取柱或相当者：500 mg，6 mL。使用前分别用 5 mL 甲醇和 10 mL 水预处理， 保持柱体湿润。 4.6 青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林：纯度≥99％。 4.7 青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质，分别 用乙腈配制成浓度为 1.0 mg/mL 的标准储备溶液。储备液贮存在-18℃冰柜中。 4.8 青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林标准工作溶液：根据需要吸取适量青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林标准储备溶液，用空白样品稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液。 5 5.1 5.2 仪器 液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 分析天平：感量 0.1 mg 和 0.01 g。 1 DB13/T 1384.1—2011 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 6 漩涡混匀器。 固相萃取真空装置。 微量进样器：25 μL，100 μL。 刻度样品管：5 mL，精度为 0.1 mL。 真空泵：真空度应达到 80 kPa。 pH 计：测量精度 0.01。 氮吹仪。 高速离心机。 测定步骤 6.1 试样溶液的制备 称取 5 g 试样（精确到 0.01 g）置于 100 mL 离心管中，加人 45 mL 去离子水，于漩涡混匀器上快 速混合 5 min，以 5 000 r/min 离心 10 min，将上清液移至 Oasis HLB 柱中，以小于或等于 3 mL/min 的 流速通过固相萃取柱后，用 5 mL 水洗柱，弃去全部流出液。在 65 kPa 的负压下，减压抽干 20 min，最 后用 3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于刻度样品管中，于 40℃水浴中用氮吹仪吹干，用乙腈定容至 1 mL， 摇匀后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 6.2 测定 6.2.1 液相色谱条件 色谱柱：SunFireTM C18 3.5 μm，150 mm×2.1 mm 或相当者。 流动相及流速见表 1。 柱温：30℃。 进样量：20 μL。 表1 6.2.2 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速/（μL /min） 水（含 0.4％乙酸）/（％） 乙腈/（％） 0.00 200 60.0 40. 0 15.00 200 35.0 65. 0 15.01 200 60.0 40. 0 25.01 200 60.0 40. 0 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测。 定性离子对、定量离子对，见表 2。 其余质谱条件见附录 A。 2 DB13/T 1384.1—2011 表2 定性离子对与定量离子对 青霉素 G 青霉素 V 氨苄西林 阿莫西林 定性离子对 335/160 351/160 350/192 366/114 （m/z） 335/176 351/192 350/160 366/208 335/160 351/160 350/160 366/208 定量离子对 （m/z） 6.2.3 液相色谱－串联质谱测定 6.2.3.1 定性测定 在相同试验条件下，样品中待测物质与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5％之内； 样品色谱图中各定性离子对相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的色谱图中离子相对丰度相比，若偏差 不超过表 3 规定的范围，则可判定为样品中存在该残留。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 6.2.3.2 定量测定 在仪器最佳工作条件下，用青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林标准储备溶液配成的基质混 合标准溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准 工作曲线对样品进行定量，样品溶液中青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林的响应值均应在仪器 测定的线性范围内。 在上述色谱条件下，青霉素 G、青霉素 V、氨苄西林、阿莫西林的总离子流图与保留时间见附录 B。 6.3 平行试验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。 6.4 空白试验 除不称取试样外均按上述分析步骤进行。 7 结果计算 从标准工作曲线上得到试样中相应的 β-内酰胺类药物浓度后，结果按公式(1)计算： X = c × V × 1000 ………………………………………………（1） m × 1000 式中： X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）。 3 DB13/T 1384.1—2011 c——从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。 V——试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）。 m——最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。 注：计算结果需将空白值扣除。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。 4 DB13/T 1384.1—2011 AA 附 录 A （资料性附录） 参考质谱条件 A.1 A.２ A.３ A.４ A.５ A.６ 电喷雾电压：5 500 V。 雾化气压力：0.055 MPa。 气帘气压力：0.079 MPa。 辅助气流速：6 L/min。 离子源温度：400℃。 去簇电压（DP），聚焦电压（FP）、碰撞能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP），见表A.1。 表A.1 名称 青霉素 G 青霉素 V 氨苄西林 阿莫西林 去簇电压，聚焦电压、碰撞能量及碰撞室出口电压 定性离子对 定量离子对 碰撞能量 去簇电压 聚焦电压 碰撞室出口电 （m/z） （m/z） v v v 压/v 45 200 11 40 200 11 20 200 11 21 200 11 335/160 335/176 351/160 351/192 350/192 350/160 366/114 366/208 335/160 351/160 350/160 366/208 20 23 20 15 23 20 30 19 5 DB13/T 1384.1—2011 BB 附 录 B （资料性附录） 四种β－内酰胺类药物标准物质的总离子流图 1——阿莫西林，2.49 min； 2——氨苄西林，9.80 min； 3——青霉素 G，12.70 min； 4——青霉素 V，13.49 min。 _________________________________ 6