ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 791—2012 禽流感病毒 ELISA 检测方法 Enzyme-linked immunosobent test for the detection of avian influenza virus 2012 - 01 - 06 发布 湖北省质量技术监督局 2012 - 03 - 01 实施 发 布 DB42/T 791—2012 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 缩略词............................................................................................................................................................. 1 3 实验原理......................................................................................................................................................... 1 4 实验条件......................................................................................................................................................... 1 5 实验材料......................................................................................................................................................... 1 6 样品处理......................................................................................................................................................... 2 7 实验方法......................................................................................................................................................... 2 8 结果判定......................................................................................................................................................... 3 9 注意事项......................................................................................................................................................... 3 附录 A.................................................................................................................................................................... 4 I DB42/T 791—2012 前  言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫 病预防控制中心。 本标准主要起草人：金梅林、张安定、董晓辉、钟广汉、徐高原、陈焕春、郭学波、孙小美、 李淑云、周艳君。 II DB42/T 791—2012 引  言 高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）是严重威胁养禽业发展的烈性传染病， 给养禽业造成了巨大的损失。禽流感病毒具有多型、易变的特点。近年来禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）跨越了中间宿主直接感染人类，对公共卫生安全的威胁引起了广泛的关注。 本标准规定了禽类的咽/鼻拭子、肛拭子、内脏组织、鸡胚尿囊液、细胞培养物中禽流感病毒的 ELISA 检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性，准确度高、重复性好，适用于临床大量样品的快速检测 和禽流感诊断。 III DB42/T 791—2012 禽流感病毒 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了禽流感病毒 ELISA 检测方法的缩略词、实验原理、实验条件、实验材料、样品处理、 实验步骤、结果判定和注意事项等。 本标准适用于禽类咽/鼻拭子、肛拭子、内脏组织、鸡胚尿囊液、细胞培养物中禽流感病毒的检测。 2 缩略词 下列缩略词适用于本标准。 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay):酶联免疫吸附试验 OD630nm 值:630 纳米波长处的吸光值 HRP:辣根过氧化物酶 S:样品测定孔 OD630nm 值 3 实验原理 本方法使用抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体包被固相载体酶标板。加入供试样品后，如果样品中 含有禽流感病毒即可发生抗原抗体反应，再加入兔抗禽流感病毒的多克隆抗体，能继续反应形成抗原抗 体复合物，并和相应的酶结合物结合，在遇到相应的底物时，复合物中的酶能催化底物反应发生显色。 其显色的深浅与相应的抗体量成正比，可借助 OD630nm 值的大小进行定性判断。 4 实验条件 4.1 实验室 实验操作宜在常温（18 ℃～25 ℃）进行。 4.2 仪器 台式低温高速离心机、微量移液器、冰箱、恒温箱、酶标检测仪。 4.3 人员 注意个人防护和环境保护。 5 实验材料 5.1 5.2 5.3 抗禽流感病毒单克隆抗体。 酶标板：96 孔板，可拆。 兔抗禽流感病毒的多克隆抗体：由灭活的禽流感病毒免疫家兔制备。 1 DB42/T 791—2012 5.4 5.5 5.6 5.7 酶结合物： HRP 标记的羊抗兔抗体。 阳性对照：含禽流感病毒的鸡胚尿囊液灭活处理。 阴性对照： 未接种禽流感病毒的鸡胚尿囊液。 其他试剂 包被液、封闭液、洗涤液、样品处理液 A、样品处理液 B、底物液 A、底物液 B、终止液（见附录 A） 6 样品处理 6.1 咽/鼻拭子、肛拭子 用无菌棉拭子于禽的咽喉或鼻腔、泄殖腔中沾取渗出液，然后浸泡于 1 mL 样品处理液 B 中，涡旋 仪震荡 1 min 后挤出棉拭子中的液体，冻融 3 次后于 37 ℃孵育 15 min，12,000 r/min 离心 5 min，取上 清。 6.2 内脏组织 剪取组织块约 1 g，置于匀浆器中，加入 1 mL 样品处理液 A 后匀浆，冻融 3 次后，置于 37 ℃下 15 min，10,000 r/min 离心 5 min，取上清。 6.3 鸡胚尿囊液 用样品处理液 B 等体积稀释后，置于 37 ℃ 15min，每隔 3 min～5 min 混匀 1 次，10,000 r/min 离 心 30 sec～60 sec，取上清。 6.4 细胞培养物 细胞培养物可直接用于检测或者冻融一次后检测。 7 实验方法 7.1 抗禽流感病毒的单克隆抗体用包被液稀释到工作浓度（5 μg/mL），加入酶标板，100 μL/孔，37℃ 孵育 2 h。加入封闭液，200 μL/孔，于 37 ℃封闭 2 h，取出酶标板在吸水纸上拍干，于 2 ℃～8 ℃保 存备用。 7.2 取单抗包被板，先用洗涤液洗板 1 次，再加入处理好的待检样品，100 μL/孔；加入阳性对照和阴 性对照各 1 孔，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min。 7.3 取出单抗包被板弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗板 3 次，200 μL/孔。每次静置 3 min 后倒掉液体，在吸水纸上拍干。 7.4 将兔抗禽流感病毒的多克隆抗体稀释到工作浓度（10 μg/mL），100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min。 7.5 重复 7.3 操作步骤。 7.6 加入酶结合物，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min。 7.7 重复 7.3 操作步骤。 7.8 加入底物液 A 和底物液 B，各 50 μL/孔，混匀，置室温下（18 ℃～25 ℃）避光显色 10 min。 7.9 加入终止液，50 μL/孔，混匀。 7.10 用酶标仪测定各孔的 OD630nm 值，应在加入终止液后 10 min 内完成。 8 2 结果判定 DB42/T 79