ICS 67.120.20 B 40 团体 标准 T/SHZSAQS 012—2020 绵羊尾脂脂肪 RNA提取技术规程 2020- 12 - 26发布 2020 - 12 - 31实施 石河子市质量标准化协会 发布 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 012—2020 I 目 次 前言 ................................ ................................ ................ II 1 范围 ................................ ................................ .............. 1 2 提取绵羊尾脂 RNA砸碰锤装置 ................................ ........................ 1 2.1 砸碰锤装置锤体参数 ................................ .............................. 1 3 提取绵羊尾脂脂肪 RNA操作步骤 ................................ ...................... 1 3.1脂肪组织样品均质化 ................................ ................................ 1 3.2液相分离 ................................ ................................ .......... 1 3.3 RNA沉淀 ................................ ................................ ......... 1 3.4 RNA洗涤 ................................ ................................ ......... 2 3.5重新溶解 RNA ................................ ................................ ...... 2 3.6 RNA质量检测 ................................ ................................ ..... 2 附录A（资料性附录） 砸碰锤装置侧视图 ................................ ........ 3 附录B（资料性附录） 总RNA琼脂糖凝胶电泳图 ................................ .......... 3 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 012—2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准附录 A、B为资料性附录。 本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：甘尚权、刘守仁、王新华、徐梦思。 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 012—2020 1 绵羊尾脂脂肪 RNA提取技术规程 1 范围 本规程规定了提取绵羊尾脂 RNA的砸碰锤装置参数、提取绵羊尾脂 RNA操作步骤、 RNA检测等 技术内容。 本规程适用于绵羊尾脂脂肪 RNA的提取。 2 提取绵羊尾脂 RNA砸碰锤装置 本标准设计的砸碰锤装置是一种在分子生物学实验中使用的震荡装置。 其由锤体和与锤体固定 连接的手柄组成。 2.1 砸碰锤装置锤体参数 锤体由一可开关的透明圆柱形密闭盒体和有弹性的橡胶块组成。密闭盒体由盖体和杯体组成， 其高为8.0～14.0 cm，底面直径为 4.0～6.0 cm。橡胶块的高为 1.5～2.0 cm，底面直径为 4.0～6.0 cm。 3 提取绵羊尾脂脂肪 RNA操作步骤 3.1脂肪组织 样品均质化 由于脂肪组织中含有大量油脂， RNA丰度极低，提取脂肪组织 RNA时，取150～200 mg绵羊尾部 脂肪组织样品，放入 5.0 mL离心管中，加入 1.2 mL TRIzol 试剂，先使用组织破碎仪 25000rpm 转速 下匀浆5 min，再将匀浆液转移至含有若干钢珠的 1.5 mL离心管中旋紧管盖，将离心管放入砸碰锤 装置中，在距离桌面高 30cm处向硬物支持面敲击 20次，停顿后重复 5～6遍。 3.2液相分离 均质化的脂肪样品于 15～30 ℃孵育5 min，加0.2 mL氯仿旋紧管盖，将离心管放入砸碰锤中从 距离桌面高 30 cm处向硬物支持面敲击 20次。15～30 ℃孵育2～3 min后，于2～8 ℃、12000 ×g下 离心15 min。混合物会分离为下层的红色 有机相、中间层以及上层无色水相， RNA存在于水相中。 3.3 RNA沉淀 将含有RNA的水相转移至一个新的离心管中，加入 0.5 mL异丙醇混合，以从水相中沉淀 RNA。 室温孵育10 min后，于2～8 ℃、12000 ×g下离心10 min。离心后会在管侧面和底部形成一个凝 胶样沉淀。 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 012—2020 2 3.4 RNA洗涤 将步骤3.3处理后的上清去除，用 75 %乙醇溶液洗涤 RNA沉淀，涡旋混合， 2～8 ℃、7500 ×g 离心5 min。 3.5重新溶解 RNA 将步骤3.4洗涤的RNA沉淀真空干燥 5～10 min，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA的溶解度， 加20～30 μL无RNA酶的水中吹打几次溶解 RNA，并在55～60 ℃孵育10 min，获得RNA溶液。 3.6 RNA质量检测 用0.7 %琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，利用 核酸蛋白分析仪测定 RNA的纯度和浓度。 0.7 %琼 脂糖凝胶检测 RNA，28S、18S和5S三条带比较清晰， 28S条带亮度约为 18S条带亮度的 1～2倍，无明 显DNA和蛋白质污染，说明 RNA完整性较好。 RNA样品经核酸蛋白分析仪检测 A260/A280 在1.9～2.0 之间，说明提取总 RNA纯度较高。 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 012—2020 3 附 录 A （资料性附录） 砸碰锤装置侧视图 1、盖体；2、杯体； 3、橡胶块； 4、手柄 A 附 录 B （资料性附录） 总RNA琼脂糖凝胶电泳图 —28S —18S —5S 全国团体标准信息平台